摘要介绍一种眼组织透射电子显微镜标本制备方法。组织先用4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液预固定，1%四氧化锇固定液后固定，丙酮逐级脱水，延长Epon812包埋液的浸透时间并包埋，用玻璃刀或钻石刀作超薄切片，醋酸铀及枸椽酸铅双重染色，H600-Ⅳ型透射电子显微镜观察。此方法的优点在于眼组织各层超微结构保存良好，没有损伤及变性，我们对该方法的操作要点作了讨论。

A Method of Preparing the Section of Eye Tissue for

Transmission Electron Microscopy

Tang GuoTang XiaojiaGan Dequan

Electron Microscopy Laboractory, West China University of Medical Sciences，Chengdu610041

AbstractA method of preparing the section of eye tissue for transmission electron microscopy (TEM) is recommended. The tissue was prefixed with a mixed solution of 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde and followed by softening in 3% EDTA solution for 20 minutes, then the tissue was fixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in series acetone, infiltrated in Epox 812 for a longer, and embeded.Ultrathin sections were cut with glass knives or diamond knife, stained with uranyl acetate and lead citrate and examined with H600-Ⅳ. The advantage of this method is that the ultrastructures of tissues are well preserved without any damage and distortion. The main points of the procedure of preparation have been discussed.

Key wordsEye tissueTransmission electron microscopyPreparation of specimen for TEM

1前言

眼组织结构复杂，眼球外形近似球体，外层巩膜为致密的结缔组织而内层又是较柔软的视网膜，易扭曲或剥离，角膜含大量纤维组织，眼球腔内有胶状玻璃体。根据眼球的特点，其制样难度极大，经过多年的探索，作者参考了国内外文献^［1～4］，在制样过程中采取了相应的方法，获得了满意的结果，现报道如下：

2材料和方法

2.1材料

将大白鼠麻醉或断头后，立即摘去眼球，并保留视神经，其过程在2 min之内完成。

2.2方法

2.2.1取材与预固定将摘出的眼球用0.1 M磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)洗净表面的血液，立即浸入4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液中，用4号针头沿赤道部将眼球打一小孔，将针头轻轻退出约1 mm，用空针缓缓推入预固定液，在预固定12 h后，沿赤道部将眼球割成二半，分别取出各种组织，组织切成1 mm³大小，继续固定2 h，然后用3%EDTA-Na₂软化20 min。

2.2.2清洗0.1M磷酸缓冲液反复清洗5次，每次10～20 min，并浸泡过夜。

2.2.3后固定1%四氧化锇固定液固定2 h(4 ℃)。

2.2.4脱水用30%、50%、70%的丙酮各脱水5～10 min(4℃)，90%的丙酮脱水10～15 min(室温)，100%丙酮脱水40 min(换三次)。

2.2.5浸透用Epon812包埋液+丙酮(3∶1)浸泡45 min(35 ℃)；纯Epon812包埋液浸泡2 h(45 ℃)。

2.2.6包埋将经以上步骤处理的样品，放置定向包埋模具中，方向应为保持所需眼组织的全层结构为准。加入新鲜的Epon812包埋液，使组织完全浸泡于包埋液中。

2.2.7聚合在45 ℃下聚合10 h，在60 ℃下聚合12 h。

2.2.8修块、半薄切片、超薄切片、染色按常规进行，H600-Ⅳ型透射电镜观察。

3结果与结论

3.1结果

用该方法制备的样品，包埋块硬度适当，无过硬过脆现象，在切片过程中，切片韧性较好，切片厚度可达500～600 nm，切片颜色为浅黄色，无散片现象，包埋液浸透良好。

超薄切片在电镜下观察，各种组织的超微结构清晰可见，如视网膜中的各层组织，角膜上皮组织，虹膜组织等。在视网膜色素上皮细胞中可见，细胞核、色素颗粒、线粒体。角膜上皮细胞中可见细胞核、核仁、粗面内质网、线粒体、微丝等，胞间可见桥粒。其超微结构保存良好(图1、2)。

图1透射电镜下示视网膜色素上皮细胞，细胞中线粒体(Mi)、内质网(ER)、细胞核(N)及色素颗粒(↑)等细胞器清晰可见。EM×8000

Fig 1Retinal pigmented epithelial cell，The mitochondria (Mi),endoplasmic reticulum (ER)，nucleus(N),melanosome(↑) and other organells in the cell are clearly shown.EM×8000

图2透射电镜下示角膜上皮细胞，细胞中可见细胞核(N)、内质网(ER)、线粒体(Mi)及微丝(MF)等细胞器，细胞间可见桥粒(De)。EM×12,000

Fig 2Corneal epithelium，There are distinet nucleus(N),endoplasmic reticulum(ER),mitochondria(Mi),microfilament(MF),intercellular desmosome(De) and other organells.Em×12,000

3.2讨论

取材与预固定是眼组织透射电镜制样的关键，我们采用的沿赤道部位打孔的方法，可使内腔的压力降低，可以使预固定液充满眼球内腔，使内层组织固定充分，又可防止视网膜组织的卷曲或脱落。取材时不应将视神经保留，这样对二次取材确定组织的方位有所帮助。操作时应注意取材时应尽快将其浸入固定液，以防止出现细胞自溶现象，整个操作应动作轻，切忌损伤视网膜。对含有大量纤维的角膜可采取3%EDTA-Na₂软化，对切片质量及组织反差都有所提高。固定液应采用4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液，该固定液的穿透力较单纯戊二醛固定液强，特别对有致密的结缔组织固定较好。脱水应根据不同的组织而定时间，如视网膜组织脱水时间应相应缩短，以防止过度脱水，组织扭曲变形变脆，如角膜组织含有大量纤维组织，其脱水时间应适当延长，以保证脱水充分。包埋液浸透应适当延长浸透时间，勤搅动，用以保证浸透充分。

参考文献

1罗清礼.视网膜色素变性的色素上皮细胞光镜和电镜观察.眼底病，1991；7∶150

2Itoi M, Kodama R, Tokayama S. Ultrastructural observation of typical gap junctions in human foetal lens nucleus. Curr Eye Res，1991; 10∶1

3Vinuesa MJ， Hernandez-Galiea E, Barahona JM. Ultrastracture study of Schlemm's canal-trabecular mashwork in traumatic galucoma. Chibret Int J Ophthalmol, 1990; 7(2)∶17

4Tousimis AJ， Fine BS. Ultrastructure of the iris: an electron microscopic study. Am J Opthalmol, 1959; 48∶397

收稿：1998-04-10