刘欣综述石应康祝彼得审校

摘要体内细胞与体外培养细胞差异的关键在于细胞分化，内皮细胞的分化是检测内皮细胞差异的核心问题。内皮细胞在体内分布广泛，其分化表现出极大的异质性，体外培养血管内皮细胞的分化也表现出极大的差异。本文介绍了内皮细胞的胚胎起源、内皮细胞的异质性及影响内皮细胞分化的因素等方面的研究进展，揭示内皮细胞分化的分子机理，将使人们可驾驭其分化，按人们要求使内皮细胞发生特定的分化。

Differentiation of Cultural Endothelial Cells

Liu XinShi YingkangZhu Bide

Department of Cardiothoracic Surgery, The First University Hospital, West China University of

Medical Sciences, Chengdu610041

AbstractThe disparity of function and ultrastructural characteristics between cells in vivo and cultural cells in vitro has been attributed to the differentiation of cells, so differentiation is the key to detecting the differences between endothelial cells (ECs). The ECs are widely distributed over the entire inner surface of blood vessels in the body and exhibit noticeable heterogeneity. The cultural ECs also show heterogeneity. This is a literature review focusing on the recent advance in researches on the embryonic origin of ECs, the heterogeneity of ECs and the factors that influence differentiation of ECs. Also described is the prospect of studies aimed at elucidating the molecular mechanisms involved in the differentiation of ECs. It is hoped that future studies will enhance the realization of oriented differentiation of ECs.

Key wordsCultureEndothelial cellsDifferentiation

血管内皮细胞(ECs)位于整个循环系统的内表面，它不仅是血管的被动衬里，而且在调节血液流动性、血管张力及通透性，参与正常和新生组织的血管形成，在病理或生理条件下血细胞的激活及迁移等方面均发挥重要作用。1963年Maruyama首先建立体外培养ECs方法，为研究ECs的功能特性及相关疾病做出了重大努力，近年有关ECs的研究愈加广泛与深入，并成为多门学科研究的热点。ECs体外培养与体内环境毕竟存在巨大差异，但其增殖方式是相同的，均赖于有丝分裂。体内外细胞的差异关键在于细胞的分化，因而ECs的分化是检测ECs差异的核心问题。ECs在体内分布广泛，其分化表现出极大的异质性，体外培养ECs的分化也有极大的差异。本文简扼综述培养ECs分化的有关方面进展。

1培养细胞的分化改变

当前人工模拟体内环境技术已逐步完善，细胞生活在人工培养条件下不仅能很好的生存、生长和增殖，在一定程度上已能使培养细胞的分化按人们的意志发展。但人工模拟条件与体内实际情况仍不完全相同，细胞置于体外培养后，一旦失去神经体液的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化是必然的。培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现“返祖”现象，表现为细胞趋单一性或具恶性性状^［1］。细胞分化机制的复杂性是在细胞与细胞，细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由众多基因参与，经多阶段和多环节完成的动态演变过程。失掉上述体内关系时细胞分化可发生改变：(1)不适应性，即由于环境的改变而出现的变化，体外培养时间越长，分化改变越大。(2)去分化性，即细胞失掉发生分化的能力，总的来说体外培养细胞随细胞来源种属和遗传性状的不同，很多细胞呈现着一定程度的分化表达现象，与体内条件越近时，细胞愈易发生分化，离体培养时间越长分化能力越差。培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。细胞产生某一特定蛋白质的表达过程可视为分化表达现象。

2血管ECs的胚胎起源

研究ECs的胚胎来源及其分化对研究ECs体外的分化很有帮助。ECs的前体细胞叫成血管细胞，它是具有潜在分化为ECs但无ECs特征，未形成管腔的一种细胞类型。胚体内外血管的形成有较大差异，在卵黄囊，ECs与血岛中的造血干细胞分化发生一致，周围细胞形成血管ECs，中央造血干细胞形成原始血细胞游离于腔内。在主动脉，ECs来源于胚内中胚层单独分化的成血管细胞，无造血干细胞的一致分化。决定造血干细胞在血岛与ECs一致分化而在主动脉分化受抑的机制仍不清楚。在原始血管系统开始循环后，原始的毛细血管丛经多次重塑形成具不同直径和功能的成熟血管系统，在同一毛细血管血流方向可多次改变。ECs在胚胎及生后发育期均增殖迅速，成熟后停止或增殖很低^［2］。这些过程的分子机理仍知之甚少，近年的研究取得了一定进展，血管ECs生长因子受体-2(VEGFR-2即Flk-1)是已知最早表达在分化为成血管细胞的中胚层细胞，后来胚胎发育过程中固定于ECs，与其配体VEGF功能一致，均作为ECs生长和血管通透性的调节因子。VEGF在内胚层表达，因内胚层与中胚层相邻近，内胚层分泌的VEGF，起旁分泌作用，可能促进中胚层细胞表达VEGFR-2成为成血管细胞，如内胚层缺乏，中胚层将无ECs形成，因此一定浓度的VEGF是VEGFR-2持续表达的必要条件，缺乏将导致细胞受体的下调，并影响其分化^［3］。Vittet等利用胚胎干细胞建立体外模型可用于研究血管形成及ECs分化的分子机理。利用该模型研究提示ECs在不同的分化阶段表达不同的抗原，如Flk-1在干细胞分化3 d后首先表达，其后血小板ECs粘附分子(PECAM)、tie-2表达，5 d时表达VE-Cadherin和tie-1^［4］。在人生长发育过程中，只有少数胚胎期的血管保留下来，多数的原始血管丛均退变，如软骨区毛细血管退变以利软骨分化；伤口毛细血管在伤口愈合后也发生退变，有证据表明ECs在这些过程中死亡，其分子机理仍不清楚^［2］。近来研究提示蛋白酪氨酸磷酸化酶积极参与ECs凋亡信号的转导及可能通过调节P21的表达，而抑制ECs的分化。胚胎发育期无血流的毛细血管优先退化，可见血流也是决定因素之一。其退变可能是某种因子的缺失、内在的细胞基因阻断或遗传的程度化过程，退变涉及程度化ECs死亡(即ECs凋亡)，是ECs分化的一个程序化过程^［5］。

3ECs的异质性

血管ECs的异质性指血管ECs之间的结构、功能、抗原成分和代谢特征等均不相同，不同器官、相同器官的不同部位，甚至在同一个微血管襻的不同节段之间的ECs都可表现出异质性^［6］。ECs的异质性反映了ECs分化的差异。

3.1结构与形态的异质性

人体的微血管ECs至少有三种类型：(1)窦状ECs分布于肝、脾、骨髓；(2)有孔ECs分布于肾脏、内分泌腺以及胃肠粘膜；(3)连续ECs分布于横纹肌、心肌、平滑肌；另外特化的ECs分布于脑、视网膜，ECs间有连续的紧密连接，并有桥粒加强，是血脑屏障、血视网膜屏障的组成部分。即使采用相同的分离技术在相同条件下培养，得到的ECs也可能有一定差异。Pupnick等将大鼠脑微血管ECs在相同条件下培养，结果出现四种不同类型的ECs：(1)弯曲和细长的；(2)铺路石样的；(3)弯曲和轻度放射状的；(4)十分开展的。这四种ECs生长融合后的表型也不同，它们之间的血栓素B2(TXB2)生长、血管紧张素转化酶(ACE)活性、胶原合成和细胞融合的密度均不同。该作者认为这些差别的原因可能是这些ECs来源不同。

3.2功能和代谢的异质性

ECs不同的形态结构也就决定了它不同的生理功能和代谢特征。Jaffe指出ECs可以合成和分泌许多类型的胶原，但不同来源的ECs差别很大。培养的人脐静脉ECs分泌Ⅳ型胶原；牛主动脉、肺动脉和肠系膜静脉ECs分泌Ⅲ型胶原；牛的肾上腺微血管ECs分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原。目前尚不清楚这些差别究竟因为培养ECs的种属不同或同一品系受试ECs的取材部位不同^［7］。Johnson等证实培养人动脉ECs比静脉ECs产生前列环素(PGI2)的能力强，产生ACE的活性前者是后者的5倍，大量的文献证实血管ECs释放花生四烯酸衍生物受培养条件的影响，其释放PGI2在ECs指数生长期最大，生长融合后减少。随加入培养基中的血清成分及所占比例的不同，将影响培养ECs合成PGI2及其它的花生四烯酸衍生物^［6］。Dichek等^［9］观察到同种ECs的传代次数不同时，其基因表达能力亦有差异。他们对传1代(P₁)和传21代(P₂₁)的脐静脉ECs进行northern分析后发现，P₂₁的t-PA、PAI-1、尿激酶和血凝调节素的 mRNA水平高于P₁；但P₁的thromobospondin、血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和蛋白S的mRNA水平高于P₂₁。因而认为传代次数和培养时间是导致这些基因表达出现差异的重要因素。

3.3抗原和表面分子分布的异质性

ECs抗原表达及各种表面分子表达的不同反映了其分化的差异及功能的不同^［10］。激活的细胞因子诱导的ECs及其表达的各种表面分子在各病理状态均起重要作用，包括感染、肿瘤血管形成、伤口愈合。vWF抗原是ECs的标志性抗原，但不同来源的ECs的vWF抗原并不相同。如高ECs没有vWF抗原抗血清染色，但淋巴结门动脉和门静脉管腔表面的vWF抗原呈阳性着色。这一特性<