摘要可吸收骨折内固定材料要求具有良好的生物相容性。对自行研制的可吸收羟基磷灰石/聚DL-乳酸(HA/PDLLA)复合骨折内固定材料进行了一系列生物相容性实验，包括Ames实验、微核实验、急性和亚急性毒性实验、溶血实验、凝血试验和肌肉、骨内长期植入实验。结果表明，HA/PDLLA材料无毒，无致突变性，不引起溶血和凝血。结论：HA/PDLLA复合材料具有很好的生物相容性。

Biocompatibility of Self-designed Absorbable

Hydroxyapatite/poly(DL-lactide) Composites

Guo XiaodongZheng QixinDu JingyuanZen Hui

Quan DapinYan YuhuaLi ShipuLi Xiangliang

Department of Orthopaedics, Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan430022

Biomedical Material Centre, Wuhan University of Technology, Wuhan430070

AbstractThe biocompatibility of self-designed hydroxyapatite/poly (DL-lactide) rods was evaluated both in vitro and in vivo including Ames test, micronucleus test, acute and subacute systemic toxicity test, hemolysis test, hemopexis test and long-term muscle and bone implant test. The results indicate that the material has no toxicity, no stimulation and mutation, and it does not cause hemolysis and hemopexis. Consequently, the biocompatibility of the composite was good.

Key wordsBioabsorbable materialHydroxyapatitePoly(DL-lactide)Biocompatibility

可吸收骨折内固定材料可避免二次手术取出而受到人们广泛重视，国外研制的自增强聚羟乙酸(self-reinforced polyglycolide,SR-PG-

A)、自增强聚L-乳酸(self-reinforced polylev-

olctide,SR-PLLA)及非增强聚L-乳酸(PLL-

A)已开始在临床使用^［1，2］，但PGA降解较快，并发症多，PLLA降解太慢，可在体内长期存留，它们价格昂贵，在普通X线下不能显影，只能依靠CT、MRI检测植入情况^［3］。国内只有DL-乳酸供应，聚DL-乳酸(PDLLA)强度较差，不能很好地满足松质骨骨折的内固定，为了发展国产可吸收内固定材料，我们用羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)与PDLLA复合，研制出HA/PDLLA复合内固定材料，大大提高了材料强度，用于实验性松质骨骨折取得满意效果。现参照国际标准化组织、美国试验和材料协会，以及我国对生物材料评价方面的有关办法和规定^［4～6］，对其生物相容性进行评价。

1材料与方法

1.1材料制备

以国产DL-乳酸为原料，制备PDLLA，用溶液法制备HA超微粉，10 wt%HA与PDLLA均匀混合后加工成2 mm×2 mm×12 mm的条形试件和直径4.5 mm长30～40 mm的棒材，分装后环氧乙烷消毒备用，另取4 g HA/PDLLA材料置于20 ml生理盐水中50 ℃浸提72 h，制备材料浸提液，24 h内进行试验。

1.2生物相容性试验

1.2.1Ames致突变试验将材料浸提液用无菌蒸馏水按原液、1/2、1/4、1/8、1/16原液的系列稀释成待测液；用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型TA₉₈、TA₁₀₀为指示菌株；已知致突变物敌克松(Dexon)、二氨基芴(2-AF)为阳性对照，无菌蒸馏水为阴性对照；采用平皿掺入法在加S₉和不加S₉条件下进行，经37 ℃培养48 h后观察结果，测试结果以致突变比值(MR＝诱变菌落数Rt/自发回变菌落数Rc)表示。

1.2.2微核试验选用NIH雄性小鼠30只，体重20～24 g，随机分成3组：(1)材料浸提液组(50 ml/kg)；(2)生理盐水阴性对照组(50 ml/kg)；(3)环磷酰胺阳性对照组(80 mg/kg)。在处死动物前30 h和6 h各经腹腔给药一次，处死后制备骨髓涂片，瑞氏染色，每只动物计数1000个多染红细胞，计算微核出现率并作统计学处理(t检验)。

1.2.3急性毒性试验取健康NIH小鼠20只，体重20～24 g，雌雄各半，随机分成2组，实验组按50 ml/kg剂量经腹腔注射材料浸提液，对照组注射等量生理盐水。连续观察2周，注意动物一般情况及不良反应。

1.2.4亚急性毒性试验取健康NIH小鼠20只，体重20～24 g，测体重和血常规后随机分为2组，实验组按10 ml/kg剂量经腹腔注射材料浸提液，每周5次，对照组注射等量生理盐水。3个月后复查体重及血常规，并取心、肺、肝、脾、肾标本作常规组织学观察。

1.2.5溶血试验取新鲜兔血用生理盐水释成2%兔血悬液，将材料浸提液、生理盐水(阴性对照)和双蒸水(阳性对照)各2 ml、颗粒样品2 g分别加入2%兔血悬液2 ml(颗粒样品组另补加生理盐水2 ml)，每组各5份。37 ℃水浴1 h，肉眼观察有无溶血，随即离心，取上清液1 ml，加入0.1% Na₂CO₃溶液4 ml，在722型分光光度计于540 nm处测宊各样本光密度，计算溶血率。溶血率=(样品吸光度-阴性对照吸光度)/阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100%。

1.2.6凝血试验取颗粒样品50、100、200 mg分别加入正常混合血浆中，用自动血液凝固仪于1 h内测定凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶凝固时间(TT)和纤维蛋白原，观察材料对凝血功能的影响。

1.2.7肌肉、骨内长期植入试验取健康家兔31只，体重2.0～2.5 kg，无菌条件下在距股骨髁关节面8～10 mm松质骨处作经髁横形截骨，复位后在髁间凹中心钻孔，插入一枚HA/PDLLA棒材固定，另取2 mm×2 mm×12 mm HA/PDLLA试件植入双侧骶棘肌内，术后动物自由活动，不用外固定。进行以下观察：(1)于3、6、12、24、36周各处死5只动物，作X线摄片后取股骨远端、材料周围肌肉组织、胸腺和脾脏作常规组织学观察；(2)于3、6、12周各处死2只动物，取出材料，在SX-40型扫描电镜(SEM)下观察材料表面情况。

2结果

2.1Ames致突变试验

实验组的MR值均小于2，Dexon及2-AF两阳性对照组的MR值均大于2，提示试验结果为阴性。

2.2微核试验

材料浸提液组微核出现率为3.61‰，与生理盐水阴性对照(3.20‰)无显著差异(P＞0.05)，与环磷酰胺阳性对照组(12.7‰)有显著性差异(P＜0.01)。实验组低于5‰的药典阳性标准，无致突变反应。

2.3急性毒性试验

两周内动物一般情况良好，活动、食欲正常，呼吸平稳，无惊厥、瘫痪和死亡现象，按WHO化学物质急性毒性试验标准，经腹腔注射LD₅₀＞15 g/kg。

2.4亚急性毒性试验

3个月内动物饮食正常，体重明显增加(P＜0.05)，血常规与给药前无显著差异(P＞0.05)。心、肺、肝、脾、肾标本组织学观察未见组织和细胞的变性及坏死。

2.5溶血试验

实验组和生理盐水阴性对照组均无溶血现象，双蒸水阳性对照组全部溶血。除阳性对照组外，其余3组溶血率均低于1%，符合规定不大于5%的标准。

2.6凝血试验

加入不同剂量颗粒样品后，血浆中4项指标均正常，说明材料对凝血功能无影响。

2.7肌肉、骨内长期植入试验

所有动物伤口I期愈合，无感染和窦道形成。肌肉内植入实验组织学观察3周时未见炎性细胞聚集及肌肉坏死，12周材料开始降解，36周时材料植入区部分被网状结缔组织和少许纤维肉芽组织修复，有少许中性粒细胞和巨噬细胞浸润，未见多核巨细胞。骨内长期植入实验X线摄片见6周时骨折愈合，无畸形(图1)。材料在12周前可清晰显影。组织学观察3周时骨折端有明显骨痂生成，材料在髁部与骨组织直接接触，在髓腔中材料周围有明显新骨生成，无中性粒细胞、淋巴细胞聚集，偶见巨噬细胞(图2)。6周时骨折均愈合，炎性细胞减少。36周时材料在进一步降解和被新骨和纤维组织修复中，可见活跃的成骨细胞和少许中性粒细胞、巨噬细胞和多核巨细胞(图3)。各组动物胸腺和脾脏组织学检查未见异常反应，淋巴胞增殖中心无增殖反应。SEM观察见材料植入前表面仅少许HA分布，植入后材料表面早期即有HA结晶沉积，6周时最多，分布均匀(图4)，12周时HA有所减少。

图1术后6周骨折愈合，材料可清晰显影

Fig 1All osteotomies united within six weeks, the implant could be seen clearly under conventional X-rays

图2术后3周髓腔中材料周围明显新骨生成，新骨表面覆盖<