摘要采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法等方法研究了3T3成纤维细胞和巨噬细胞在含重组人碱性细胞生长因子(rhbFGF)培养基血纤维上的生长行为。结果显示：在低血清含rhbFGF的培养条件下，两种细胞在血纤维能够良好生长。本研究揭示，血纤维不仅可以作为生物支持材料用于三维组织培养，而且也可作为rhbFGF促进细胞生长的生理性载体。

Go-culture 3T3 Fibroblast and Macrophage on Blood

Fibrin Glot with rhbFGF

血纤维是血液凝固过程中生成的一种生理性基质，对于相同来源的生物体的组织或器官具有低免疫原性或无抗原性的特点，因此，在创伤修复上的有广泛的用途。碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种广泛分布于人体各种细胞但含量极微的生物活性物质，具有促进多种细胞增殖、微血管的生长和分化、神经元的存活以及修复各种软组织等多种重要的功能。本文报道了基因工程重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)存在下，小鼠3T3成纤维细胞和巨噬细胞在血纤维上的生长行为，旨在探讨血纤维联合rhbFGF使用作为仿生生物材料应用的可能性。

1材料与方法

1.1主要仪器、材料和试剂

CO₂培养箱：ELD311酶标自动读数仪(BIO-TEK INSTRUMENTS)；PM-6倒置相关显微镜(OLYMPUS)；MTT及异丙醇为Sigma公司产品；青霉素、链霉素、胰蛋白酶、DMEM及胎牛血清为Gibco公司产品；rhbFGF为我所基因工程生产纯化产品。

1.2小鼠血纤维的制备

在无菌条件下，将Balb/c小鼠的眼球分别快速摘除取血，滴入离心管内，并静置30 min，离心除去血清。将血凝物用双蒸水和双抗液漂洗。将处理过的血纤维切成一些小块，置于培养瓶的中部，以无菌纱布包扎瓶口后置真突冷冻干燥机内干燥冷冻固定备用。

1.33T3成纤维细胞和巨噬细胞

为暨南大学生物工程研究所保存。

1.4四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法

培养一定时间的细胞加入MTT溶液10 μl/孔后继续培养4 h，再分别加入酸化异丙醇100 μl/孔，充分混匀静置，以ELS311酶标自动读数仪测OD值。

2结果和讨论

2.1rhbFGF对3T3成纤维细胞和巨噬细胞存活及增殖的影响

MTT实验结果显示，在实验组织中rhbFGF的浓度超过25 ng/ml时，即对3T3成纤维细胞产生作用；随着rhbFGF浓度的提高，其活性逐渐增强；当浓度在100 ng/ml时，其活性最强；实验浓度低于12.5 ng/ml时，OD值与对照组相比无显著差异；实验浓度高于800 ng/ml时，反而出现对3T3成纤维细胞的抑制活性，OD值与对照组相比亦无显著差异。对于巨噬细胞而言，rhbFGF的有效浓度为25 ng/ml，低于12.5 ng/ml时，OD值与对照组相比无显著差异，最佳浓度为50 ng/ml，抑制浓度为200 ng/ml。

研究结果表明，3T3成纤维细胞和巨噬细胞均能够在0.4%血清rhbFGF 50 ng/ml的培养基的血纤维上很好地粘附和生长。

2.23T3成纤维细胞和巨噬细胞在血纤维上生长的表型

3T3成纤维细胞和巨噬细胞在0.4%低血清饥饿共培养后，用含rhbFGF 50 ng/ml的0.4%胎牛血清DMEM培养液继续培养，通过相差显微镜和电子显微镜观察，实验组rhbFGF与不含rhbFGF对照组相比，能够较好维持共培养3T3成纤维细胞和巨噬细胞的生长和粘附，且随着培养时间的延长，在血纤维上生长和粘附的细胞伪足数目明显增多。在含rhbFGF 50 ng/ml 0.4%胎牛血清DMEM培养条件下，3T3成纤维细胞在血纤维上培养24 h后，细胞间通过细长的伪足相连。培养72 h后，大量的扁平细胞通过片状售足连接成一片；和3T3成纤维细胞共生的巨噬细胞在血纤维上粘附生长，细胞数目未见明显变化，与无rhbFGF的对照组相比，细胞存活时间延长。结果表明，在创伤修复过程中，血纤维不仅能够用作支持物，而且还可以作为rhbFGF的载体。

2.3吉姆萨染色观察

吉姆萨对共培养3T3成纤维细胞和巨噬细胞及血纤维的染色结果显示，3T3成纤维细胞和巨噬细胞染色后变为蓝色，而血纤维染色后变为红色，两者极易区别。而且随着细胞数目的增加，细胞的染色从浅蓝转为深蓝，结果表明吉姆萨可作为一种观察细胞在血纤维上生长和存活的理想方法。

近年来，生物材料的生物相容性问题越来越受到科学研究者的关注。血纤维是一种血浆蛋白，因此对于相同来源的生物体的组织器官具有低免疫原性或无抗原性，也没有毒性和其他不不良影响。它作为相容性好、可降解的生物材料在创伤修复临床治疗上具有广泛的用途。bFGF是可促进大多数来源于中胚叶和神经外胚叶细胞增殖的分裂原，通过自分泌或旁分泌机制引起生物效应的基本调节因子。本研究表明，基因工程药物bFGF和血纤维的联合使用能够很好地维持3T3成纤维细胞和小鼠巨噬细胞的共生，提示两者结合作为活性生物材料的可能性。

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