摘要： 目的 研究低氧时内皮细胞生长状态的变化,以揭示缺氧性肺水肿的发生机制。方法 利用体外培养的肺动脉内皮细胞(PAEC)，观察了在缺氧条件(3%O₂)下，PAEC的生长曲线、细胞周期及细胞内特征性蛋白因子的变化，对PAEC的生长状态进行了质和量综合评价。结果 在观察的48 h范围内，缺氧对PAEC的生长数量无明显影响（P＞0.05）。细胞的S期在缺氧2 h时出现了一过性的增加，同时G₀/G₁期出现了一过性的降低（P＜0.05）。但随着缺氧时间的延长，PAEC的各个生长周期均无明显变化(P＞0.05)。因子Ⅷ相关抗原(ⅧR:Ag)阳性细胞数在缺氧过程中均呈明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。 结论 缺氧时，虽然PAEC在生长数量和生长周期上无明显变化，但生长质量出现了明显的下降，这将影响其功能状态，降低血管屏障作用的发挥。

中图分类号:R364.4，R852.11文献标识码：A文章编号：1002-0837(2000)04-0290-04

Effects of Hypoxia on the Growth of Pulmonary Artery Endothelial Cell

HONG XinYIN Zhao-yunSUN Xing-binJIU Jun-pingXIE Yin-zhiLU Yong-da

（Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050,China）

Abstract: Objective To study the effects of hypoxia on the growth of pulmonary artery endothelialcell(PAEC).Method Growth number, growth cycle phase, and the characteristics of endothelial cells(factor Ⅷ related antigen) of PAEC were investigated during hypoxia using the PAEC cultured in vitro as a model. Result No difference was found between growth numbers of PAEC under hypoxia and that under normoxia conditions during the culture of 48 h(P＞0.05). The numbers of positive immunofluoescence PAEC of factor Ⅷ related antigen in hypoxic groups were lower than those in normoxic groups.The cell cycle phase figures showed that the DNA synthetic phase (S phase) in hypoxia 2 hour group was increased significantly, while the pre-synthetic phase(G₀/G₁) was decreased as compared with that of normoxic group. However, the S,G₂M(gap2 and mitotic phase) or G₁/G₀ stage of hypoxia for 12, 24 or 48 hours group all had no change as compared with those of normoxic group. Conclusion Growth of the PAEC changed significantly during hypoxia. Although the quantity and the growth cycle of PAEC showed little change, the quality was degraded seriously that its function as a permeability barrier would be affected.

Key words: hypoxia;pulmonary artery;endothelial cells;growth cycle;factor Ⅷ;antigen;growth curve

内皮细胞是覆衬于全身血管和淋巴管内面的单层扁平细胞，具有多种生理功能，它做为组织与血液间的第一道屏障在血管通透性调节中发挥重要作用^［1,2］。内皮细胞生长状态的好坏是其能否执行这些功能的先决条件。所以，在缺氧条件下，研究内皮细胞尤其是肺动脉内皮细胞（PAEC）的生长状态变化，对于探讨缺氧血管通透性改变相关疾病如缺氧性肺水肿的发病机制具有重要意义。以往研究多集中在细胞数量上，很少注意细胞生长质量的内在变化^［3,4］。本文在观察细胞生长数量的同时，研究了细胞周期和内皮细胞特征性蛋白因子的变化，对PAEC在缺氧状态下的生长状态进行了较为全面系统的评价。

方法

PAEC的体外培养^［5］选用肉联厂检疫合格的健康成年猪,1.0～1.5岁,体重100～150 kg,雌雄不限,活杀后,在相对无菌条件下分离肺动脉，并将游离下来的血管放入无菌D-Hank's液，4℃保存，2～3 h内培养。以0.25%胰蛋白酶消化内皮细胞，750 g，离心消化液10 min。弃上清,向离心管加入M199培养液(含有20%胎牛血清,10 mmol/l HEPES,双抗1 ml/dl, pH 7.0)将细胞制成悬液,吸取0.2 ml细胞悬液用0.4%台盼蓝染色后,计活细胞数,调整细胞浓度至10⁵ cells/ml接种于培养瓶中，放入37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养。定时换液并观察细胞生长情况，长成单层后及时传代。在相差显微镜下从形态学上对细胞进行鉴定，同时根据Jaff法从免疫学上对细胞进一步鉴定^［7］。

实验分组选取5～10代生长良好融合单层的PAEC，以10⁵ cells/ml密度接种于培养瓶中，待细胞长成融合单层时，更换含10%胎牛血清的培养液，随机分为缺氧组和对照组，分别观察2、12、24和48 h PAEC生长曲线、ⅧR:Ag和细胞周期的变化。缺氧组的实验条件为3%O₂、92%N₂、5%CO₂、饱和湿度；对照组的实验条件为21%O₂、74%N₂，其余条件与缺氧组相同。生长曲线测定：取各时间点的内皮细胞，消化制成细胞悬液，染色计数，求出均值。以培养天数为横坐标，细胞数为纵坐标，绘出生长曲线。

ⅧR:Ag的测定根据Jaff法对ⅧR:Ag进行荧光染色，细胞终浓度不小于10⁶ cells/ml。检测前用300目尼龙滤网过滤，将细胞制成单细胞悬液，用流式细胞仪测定PAEC的ⅧR:Ag荧光阳性细胞数。仪器条件：FACS－440型流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司），SW氩离子激光器，输出功率0.26 W，激发光波长488 nm。前置滤光片，使光电倍增管接收绿色免疫荧光，用戊二醛固定的鸡血细胞校正仪器，使仪器CV值稳定在3%以内。改变前向角以去除细胞碎片的干扰，每个样品记数1万个细胞，从中分析大小形态在正常范围内的8700左右内皮细胞，采用PDP11/73计算机Log单参数1024道直方图实时收集处理数据。

细胞周期测定真核细胞的细胞周期主要分为4个时期，即DNA合成前期(G₁期)、合成期(S)、合成后期(G₂期)和分裂期(M期)，此外还有G₀期，G₀期的细胞暂不分裂。在细胞周期中，G₀、G₁期细胞的DNA含量是相同的，都是二倍体。G₂与M期的DNA含量也是相同的都是四倍体，S期介于两者之间。通常在一个非同步生长的细胞群体中，总是G₁期细胞最多，S期次之， G₂、M期细胞最少。细胞所在的周期不同，细胞内染色体DNA含量不同，流式细胞仪根据DNA荧光强度来分析DNA的含量，从而确定各细胞周期的细胞所占比例。首先将各组的细胞悬液用70％洒精固定，碘化丙啶（PI）对细胞内DNA染色流式细胞仪分析细胞时，前置不同的滤光片，使光电倍增管接受PI发出的红色荧光。每个样品采集1万个细胞,根据每个细胞的荧光强度绘制出荧光强度频数分布图，计算机统计G₀ /G₁,S,G₂ 、M期等细胞周期中，各类细胞所占的百分比。

结果

生长曲线的变化在各培养时间取出细胞，对细胞进行计数后，绘出细胞生长曲线(图1)。无论是在缺氧或是常氧条件下，两组细胞在48 h观察范围内生长数量无明显差异(P＞0.05)。

摘要： 目的 研究低氧时内皮细胞生长状态的变化,以揭示缺氧性肺水肿的发生机制。方法 利用体外培养的肺动脉内皮细胞(PAEC)，观察了在缺氧条件(3%O₂)下，PAEC的生长曲线、细胞周期及细胞内特征性蛋白因子的变化，对PAEC的生长状态进行了质和量综合评价。结果 在观察的48 h范围内，缺氧对PAEC的生长数量无明显影响（P＞0.05）。细胞的S期在缺氧2 h时出现了一过性的增加，同时G₀/G₁期出现了一过性的降低（P＜0.05）。但随着缺氧时间的延长，PAEC的各个生长周期均无明显变化(P＞0.05)。因子Ⅷ相关抗原(ⅧR:Ag)阳性细胞数在缺氧过程中均呈明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。 结论 缺氧时，虽然PAEC在生长数量和生长周期上无明显变化，但生长质量出现了明显的下降，这将影响其功能状态，降低血管屏障作用的发挥。

中图分类号:R364.4，R852.11文献标识码：A文章编号：1002-0837(2000)04-0290-04

Effects of Hypoxia on the Growth of Pulmonary Artery Endothelial Cell

HONG XinYIN Zhao-yunSUN Xing-binJIU Jun-pingXIE Yin-zhiLU Yong-da

（Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050,China）

Abstract: Objective To study the effects of hypoxia on the growth of pulmonary artery endothelialcell(PAEC).Method Growth number, growth cycle phase, and the characteristics of endothelial cells(factor Ⅷ related antigen) of PAEC were investigated during hypoxia using the PAEC cultured in v