第四军医大学学报2000年第21卷第4期

许永华施新猷胡蕴玉刘健顾为望彭磊刘丹平

摘要：目的观察煅烧骨与培养的兔骨膜成骨细胞的组织相容性,为将复合物植入骨缺损提供实验依据.方法采用取材丰富的牛松质骨经脱脂、脱蛋白、煅烧等工艺处理制成的煅 烧骨（true bone ceramic，TBC）为载体，将体外培养的兔骨膜成骨细胞复合到TBC，4，10和20 d取材，行扫描电镜观察，设对照组.结果4 d后，煅烧骨面及 孔内即有了细胞贴附 生长，20 d全部长满，有胶原纤维形成，对照组则没有.结论煅烧骨与 成骨细胞有良好的组织相容性.

关键词：煅烧骨；成骨细胞

0引言

目前，骨和软骨组织工程的研究主要集中在细胞种植基质材料的研究开发，种子细胞性质的研究；组织培养中各种因子的调控作用.其中，细胞种植基质材料的相容性研究又是组织工程研究的重点，也是能否应用于临床的重要因素.我们采用煅烧骨做为载体，与体外培 养的成骨细胞复合，观察其组织相容性以期达到植骨目的.

1材料和方法

1．1材料采取健康的成年牛松质骨，经脱脂、脱蛋白、煅烧（800℃，3 h）等工艺制成煅烧骨（true bone ceramic TBC），经X线衍射分析和扫描电镜（scanning electro n microscope, SEM）观察证实，TBC的主要成分是羟基磷灰石（HA），纯度高，质量可靠，有天然的高密度网状孔隙结构. X-射线能谱分析结果表明，TBC载体钙磷原子数量比为1∶1.67. 接近于人骨钙磷比值，根据动物模型设计将TBC制成相应的大小形态.经高压蒸气 消毒后涂鼠尾胶原备用. 鼠尾胶原制备,见文献［1］.

1.2方法

1．2.1兔骨膜成骨细胞的制备骨膜的取材和细胞培养：实验用健康新西兰兔，雌雄不限，4 mo龄，体质量800 g，30 g·L^-1戊巴比妥钠30 mg·kg^-1, iv 麻醉，无菌操作下切取胫骨骨膜进行体外培养^［2］.

1．2.2TBC与成骨细胞的复合将传代成骨细胞制成1×10¹¹个·L-1成骨细胞悬液，将上述煅烧 骨，放入24孔板中，每孔1块.同滴管将细胞悬液滴入骨块中，待骨块被细胞悬液浸满并滋生少许后加入含200 mL·L^-1FBS 1640培养液，每孔2 mL，于37℃，50 mL·L^-1 CO₂，饱合温度条件下培养24 h，再分别将骨块移入另一孔并加入新的培养液，此后每1～2 d换液1次，并于4， 10，20 d分别取材，扫描电镜（SEM）下观察.

2结果

2．1未复合细胞载体表面SEM观察经煅烧的牛松质骨外观形态不变，色灰白，载体表面 光滑，载体孔隙300～700 μm，壁厚60～300 μm，孔隙率为85%，连续放大500倍，清楚看清牛松质骨载体表面的结构，孔壁上未见细胞贴附生长（Fig1）.

2．2复合细胞载体表面SEM观察在培养4 d的载体上可见有少量细胞生长，形态不规则（Fig 2），培养10 d的载体细胞明显增多，培养20 d载体表面细胞生长密集，胞体呈不规则半球状，从胞体伸出的细胞突起长短不一，有的与其他胞体相连，细胞在孔洞中几乎长满（Fig 3）有明显的胶原纤维分泌（F ig 4）. 上述观察结果提示：①复合细胞已在载体表面成活并贴壁生长，②细胞已发挥其合成胶原纤维的功能，表明牛松质骨经高温煅烧再加胶原处理后，有较好的生物相容性.

图 1经煅烧的牛松质骨载体电镜观察

fig 1Structure of calcined cattle cancellas bone as a vector under SEM

图 2复合细胞4d的载体电镜观察

fig 2On the 4 d situation of compounded cells on the vector under SEM

图 3复合细胞20 d的载体电镜观察

fig 3Change of compounded cells on the vector under SEM on the 20th day

图 4载体上细胞胶原分泌电镜观察

fig 4Situation of collagenic secretion by cells on the vector under SEM calcined cattle

3讨论

目前用于细胞种植的基质材料有聚乙酸（polyglycolic acid,PGA）和聚乙烯，聚乳酸( polylactic acid, PLA),磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)，羟基磷灰石(hydroxyapa tite,HA)，煅烧膏(plaster of paris,pp)，聚酣(polyanhydrides)等，其中以PGA和PLA两种有机分子聚合物应用最广，具有较好的生物相容性，可降解性及可吸收性，但其存在费用昂贵，降解率、可塑性低等不令人满意的缺点，特别应当指出的是PGA和PLA降解后的酸性代谢产物会降低聚合物周围pH值，从而影响细胞和组织生长^［3］，还可引起纤维化及可能发生周 围组织的免疫反应^［4］.异种骨取自动物，来源广，取材方便. 异种骨的不同构成对骨缺损修复有很大影响，松质骨其结构疏松，易于吸收替代长入新骨^［5］.我们用经高温 煅烧的牛松质骨作为载体，复合细胞后继续培养.实验结果表明细胞在该载体上可以良好的贴附，伸 展，生长.

细胞载体表面的贴附生长是其发挥功能的前提条件^［6］.与其他材料相比，煅 烧骨具有明显的优点，经高温煅烧，可以彻底消除其抗原性，同时保留了骨的形状，骨内天然多孔结构具有很大的内表面积，有利于细胞的植入与贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出. 充分利用了HA良好的生物相容性、骨传导性、机械承载能力、细胞易于贴附和可控降解速度等特性^［7，8］.扫描电镜证实，该材料具有原骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔 系统，空隙率为85%，孔径大小为450 μm，其大小适合肉芽组织长入和软骨分化形成，有利于传导成骨；解决了化学合成人工骨的空隙率，空隙交通孔径大小等方面制作难题.煅烧骨经我们用胶原处理后，具有良好的细胞界面，利于细胞的贴附，并为细胞在其表面生长，增殖，分化基质，提供良好的微环境；煅烧骨有一定的降解性^［9］，载体制作方法简单，组织相容性较好，不必象其他载体那样通过复杂的制作技术提高其性能，是组织较为理想的载体之一.我们采用组织工程学方法，将成骨细胞种植于煅烧骨上，在体外进行三维立体培养，使成骨细胞在载体上增殖，分化成熟，在扫描电镜（SEM）下观察了煅烧骨载体，以及复合的成骨细胞生长情况及细胞学行为，为把煅烧骨载体作为骨组织工程材料，体外组装成骨细胞以期达到植骨目的提供实验依据.

作者简介：许永华(1956-)，女（汉族），江苏省南京市人.1986年新疆 医学院医疗系毕业,主管技师，科主任，发表文章12篇，参编专著2部. tel.（0991）4992198许永华（兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科, 新疆 乌鲁木齐 830000,第四军医大学)

施新猷（兰州 军区乌鲁木齐总医院实验动物中心, 新疆乌鲁木齐 830000,第四军医大学)

胡蕴玉（西京医院全军创伤骨科研究所)

彭磊（西京医院全军创伤骨科研究所)

刘丹平（西京医院全军创伤骨科研究所)

刘健（西京医院全军创伤骨科电镜中心)

顾为望（第一军医大学实验动物中心）

参考文献：

［1］方福德，周吕，丁濂et al. 现代实验医学技巧全书［ M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996：442-443.

［2］ 许永华，王 瑞，殷学军.兔成骨细胞两种分离方法的比较［J］. 上海 实验动物科学，1999;1（2）：190-192.

［3］ Sittinger M， Bujia J，Minuth WW et al. Engineering of cartila ge tissu e using bioresorbable polvmer carriers in perfusion culture［J］.Biomaterials，1994；15(6): 451-456.

［4］ Sims CD, Butler PE, Cao YL et al. Tissue engineered neocartila ge us ing plasma derived polymer substrates and chondrocytes［J］. Plast Reconstr Su rg,1998;101(6):1580-1585.

［5］ 胡蕴玉，陆裕朴，刘伟.异种骨移植修复骨缺损实验研究［J］. 中华 骨科杂志,1990;10(1):33-36.

［6］ Nagahara S, Matsuda T. Cell Substrate and cell interactions d if ferently regulate cyloskeletal and extracellula