中国修复重建外科杂志2000年第14卷第2期

王光林杨志明解慧琪王翠莹李胜富

摘要：目的研究具有雪旺细胞(SC)活性的组织工程周围神经修复材料的构建方法。方法①采用干/湿相转化纺丝法，将分子量为730 kD的聚乳酸(PLA)制成外径为2.3 mm、内径为1.9 mm、壁厚0.4 mm、长4 cm、孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管和孔径为100～200 μm、孔隙率为85%的PLA无纺纤维布。②将SC置入细胞外基质(ECM)凝胶中，观察SC在ECM凝胶中的生长。③SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布中，观察SC在PLA支架材料中的生长。④将SC、SC/ECM和SC/ECM／PLA置入PLA中空纤维管中，桥接大鼠坐骨神经长10 mm缺损，观察SC移植后存活情况。结果①SC在ECM凝胶中，细胞生长良好，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡，降解成碎片；当ECM凝胶溃解后，加入DMEM培养基，SC游出，贴壁生长。②SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后，大部分细胞随ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，1天后开始伸出两极，3天后可见网孔中大量双极梭形细胞，部分细胞沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长。③SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现大量SC细胞存活，SC/ECM组和SC/ECM/PLA组存活细胞数量明显多于单纯SC悬液组。结论ECM凝胶能维持SC存活。PLA无纺纤维布与ECM凝胶复合是良好的携带SC的多孔生物降解材料。

关键词：雪旺细胞细胞外基质中空纤维管组织工程

近年来，随着组织工程学的兴起，提倡利用生物学和工程学原理开发能够修复、维持和改善组织功能的生物代用品，将有可能对周围神经缺损的修复探索出一条解决问题的捷径。雪旺细胞(Schwann cell,SC)是周围神经的主要结构和功能细胞，其分离、培养、分裂、增殖、标准化和保存方法目前已取得很大进展，由于其在神经再生过程中为再生轴突提供Bungner带，分泌多种神经营养物质、相关细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和神经细胞粘附分子等，在神经再生和功能恢复方面起着重要作用。因此，将SC和相应的ECM结合，与具有良好生物相容性和可渗透性、能保证SC存活、分裂、增殖和发挥其促神经再生作用的生物可降解材料复合，制成具有SC活性的组织工程周围神经修复材料，将可能对神经缺损的修复效果和功能恢复起着重要促进作用^［1～4］。

1材料与方法

1.1聚乳酸中空纤维管的制作

采用干/湿相转化纺丝法，将分子量为730 kD(1D=0.992u)的消旋聚乳酸(polylactic acid,PLA，由中国科学院成都分院化学所提供)、溶剂、添加剂置入挤出器中溶解，除泡后用纺丝器制成外径为2.3 mm、内径为1.9 mm、壁厚0.4 mm、长4 cm的管后，充分洗涤，去除添加剂后，制成孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管(图1)，环氧乙烷消毒备用。

1.2聚乳酸无纺纤维布的制作

将PLA溶解、旋转抽丝后采用无纺法制成PLA单层纤维布，叠加4～6层制成孔径为100～200 μm、孔隙率为85%的PLA无纺纤维布后环氧乙烷消毒备用(PLA中空纤维管和无纺纤维布均由四川大学纺织学院完成)。

1.3雪旺细胞培养及标记

1.3.1雪旺细胞培养按Brockes的方法：无菌取流产胎龄14～20周的人胎儿双侧坐骨神经置入Hank's液中，解剖显微镜下剔除外膜、剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶混合液消化，40～50分钟后取细胞悬液接种于预涂有多聚赖氨酸的培养瓶中37℃，5%CO₂孵箱中培养30分钟后收集未贴壁细胞重新接种于塑料培养瓶中，培养24小时后更换为含有阿糖胞苷(1×10^－5mol/L)的DMEM培养基，48小时后更换为常规DMEM培养基，培养24小时后再换为含有阿糖胞苷的培养基，培养24小时后再换为常规培养基，以去除成纤维细胞。8～10天细胞长满后SP法做S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定，SC纯度超过95%。

1.3.2雪旺细胞标记SC培养6～8天后，向培养液中加入BrdU,终末浓度为10 μmol/L，37℃，5%CO₂培养箱中孵育1～2天，DMEM液清洗三次，免疫组织化学染色细胞核呈蓝色。

1.4雪旺细胞在细胞外基质凝胶中的生长

ECM(Sigma)和DMEM(2×)在20℃下充分混合，SC以1×10⁵ ml加入ECM/DMEM中置入一次性塑料培养皿中，37℃，5%CO₂孵箱中培养；另一组在形成凝胶6小时后加入DMEM培养基，观察SC在ECM凝胶及模拟体内血清环境中的生长情况。

1.5雪旺细胞在聚乳酸支架材料中的生长

将PLA无纺纤维布在多聚赖氨酸溶液(10 μg/ml)中浸泡24小时，取出冻干，一组SC以1×10⁷/ml缓慢浸入PLA纤维布，静置6小时后，加入少量DMEM培养；另一组SC以1×10⁷/ml混入ECM/DMEM中，在20℃缓慢浸入PLA纤维布中，37℃孵育12小时后再加入DMEM，37℃，5%CO₂孵箱中孵育。

1.6周围神经材料的预构

BrdU标记的SC制成1×10⁸/ml ECM/DMEM悬液，一组缓慢浸入PLA纤维布中，37℃，5%CO₂孵箱中孵育12小时，充分整合后置入PLA中空纤维管中；另一组直接注入PLA中空纤维管中，用8%琼脂糖封口，置入DMEM培养瓶中，37℃，5%CO₂孵箱中孵育24小时，使其充分整合。

1.7周围神经材料的体内植入

取Wistar大白鼠15只，体重(250±20) g，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后显露一侧坐骨神经，造成长10 mm缺损，10只分别用上述两种材料桥接，另外5只用中空纤维管桥接后注入1×10⁸/ml SC细胞悬液作为对照组。3周后取材，10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、BrdU免疫组织化学染色，观察细胞存活情况。

1.8统计学方法

所有数据均采用SPSS/PC进行统计分析。

2结果

2.1雪旺细胞在细胞外基质凝胶中的生长

SC在ECM中形成凝胶后，1小时后呈圆形，周围一圈透亮带，1天后开始有细胞伸出两极，形态开始展开，3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞，并开始分裂、增殖，直到14天细胞生长良好，14天后随着凝胶的溃解，SC开始死亡、降解成碎片(图2)。在加入DMEM组中，SC在14天前同EMC凝胶中生长规律大致相同，只是当ECM凝胶溃解后SC游出，贴壁生长。

2.2雪旺细胞在聚乳酸纤维布上的生长

SC悬液直接浸入PLA无纺纤维布中后，大部分细胞渗漏到培养瓶中，在瓶底贴壁生长，仅少数细胞能贴附在PLA纤维上，伸展形成双极状。

SC/ECM悬液浸入PLA无纺纤维布后，大部分细胞随ECM凝胶状态的形成，滞留于PLA纤维网孔中，1天后开始伸出两极，3天后可见网孔中大量双极梭形细胞，同普通培养瓶中SC形态完全一致，部分细胞沿着纤维生长，仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长(图3)。

2.3雪旺细胞移植后存活情况

SC移植术后21天，BrdU免疫组织化学染色发现三个组均有大量细胞存活，细胞分布不均匀，部分区域聚集成团，部分区域较稀疏(图4)，SC/ECM组和SC/ECM/PLA组细胞存活数量无明显区别，而单纯SC悬液组存活细胞数量明显少于SC/ECM和SC/ECM/PLA组，SC悬液组平均每高倍视野SC数量为(180±150)个，SC/ECM组为(480±260)个，SC/ECM/PLA组为(440±230)个，经统计学处理有显著性差异(P＜0.05)。

图1PLA中空纤维神经再生引导管图2雪旺细胞在ECM凝胶中的三维生长(×100)图3雪旺细胞在PLA纤维布上的生长，部分细胞贴附在纤维上(×100)图4雪旺细胞移植后3周，大量细胞存活(免疫组织化学染色×100)

fig. 1 PLA hollow fiber conduit for guiding peripheral nerve regenerationFig. 2 SC were grown in three dimensional ECM gels(× 100)Fig. 3 SC were grown in PLA fiber net, part of cells were adhered on fibers(× 100)Fig. 4 Many SC cells were survived at 3 weeks after transplantation(Immunohistochemical stain ×100)

3讨论

SC是周围神经组织工程的核心，SC的分离、培养、纯化、传代及永生化均已取得可喜成就，但神经组织工程材料需要的细胞的数量非常巨大，SC移植要产生效果，细胞浓度量需在1×10⁸/ml以上^［5］。SC传代以后形态和功能逐渐改变，不再适合组织工程的要求，解决问题的方法是培养永生化SC系，使其分裂、增殖获得大量的细胞，Gansmmller的研究已取得初步成果，培<