第四军医大学学报1999年第20卷第2期

连建奇周永兴金由辛

摘要目的: 探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶RNA的切割作用.方法:利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒C基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体(pGEMRz123), 观察单一及串联核酶(Rz123)对靶RNA的切割作用.结果: 构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶RNA;串联核酶中的单一核酶不仅可单独作用,而且可联合切割,提高了单一核酶的剪切效率.结论: 抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶体外可联合切割靶RNA.

关键词：肝炎病毒，乙型单-核酶联合核酶切割

0引言

锤头型核酶(hammerhead ribozyme, Rz)是具有催化活性的RNA分子.由于锤头状核酶分子较小,结构简单,易于设计和合成,因而近年被广泛用于抗病毒的研究^［1，2］. 根据乙型肝炎病毒复制过程须经过RNA的生物合成阶段, 因此设计可定点切割RNA的核酶, 就有可能阻断基因表达和抑制病毒复制,从而达到防治的目的. 核酶切割活性的发挥须依赖于其空间结构的正确性^［3］和底物分子的生物学特性^［4］. 由于带有较长附加碱基序列的核酶往往影响其切割活性;以及单一核酶常常丧失对底物的切割作用.因此设计合成带有自剪切的串联核酶,可提高核酶阻断靶基因的表达效率.本研究以锤头状结构为模型,选择HBV C基因mRNA作为靶分子,设计可特异性地切割HBV RNA的单一及串联核酶,构建单一及串联型核酶分子的体外自剪切转录载体, 观察核酶对乙型肝炎病毒靶RNA的体外切割作用.

1材料和方法

1.1核酶的计算机设计选择甘人宝等^［5］发表的adr亚型乙型肝炎病毒基因序列为分析序列. 采用中科院上海生化所陆长德等^［6］的锤头型核酶设计软件设计核酶.

1.2质粒和宿主菌、试剂质粒pGEM7zf(-)和pBLuescript Ⅱ KS(+)和宿主菌TG1, JM109由上海生化所408组保存. pUC19/c-20(含HBV C基因)由上海生化所汪垣教授惠赠. 限制性内切酶、T4DNA连接酶，IPTG，X-gal购自华美公司,α-³²P-UTP 购自北京亚辉公司,T7RNA聚合酶购自BRL.

1.3自剪切转录载体(pGEMRz123)质粒的设计及体外转录质粒构建pGEMRz123质粒的设计如Fig 1, 在载体pGEMRz123的T7启动子下游依次排列有5'-顺式-核酶,Rz1,Rz2和Rz3串联核酶,3'-顺式核酶.设计的核酶基因的合成及pGEMRz123体外转录质粒构建详见文献［7］. pGEMRz123质粒构建时在5'顺式核酶上引入Sac Ⅱ酶切位点以方便真核载体的克隆和克隆载体的鉴定.将构建的pGEMRz123质粒转化JM109菌种,经蓝白筛选,快提质粒, Sac Ⅱ酶切鉴定,重组子命名为pGEMRz123,扩增,抽提,氯化铯梯度离心纯化.用双脱氧末端终止序列分析方法测定pGEMRz123质粒克隆基因序列.

图1pGEMRz123质粒示意图

fig 1Map of the plasmid pGEMRz123

1.4核酶(Rz1,Rz2和Rz3)转录质粒的构建在pGEMRz123质粒构建基础上, pGEMRz1转录时可由pGEMRz123替代, pGEMRz2可由pGEMRz123经Xba I, EcoR I双酶切去掉Rz1 (44 bp)片段得到 pGEMRz23质粒替代. pGEMRz3可由pGEMRz123经Xba I, Cla I双酶切去掉Rz12 (88 bp)片段得到.

1.5靶RNA转录载体的构建及转录pUC19/c-20质粒经BamH I和EcoR I双酶切得到700 bp的片段. pBluescript经BstX I线性化,T4DNA聚合酶削平后连接形成质粒pKS',使BstX I位点消失.再经BamH I, EcoR I双酶切; 纯化后与上述片段(700 bp)连接形成pKC(Fig 2),转化TG1菌种,小提质粒, BamH I,EcoR I双酶切鉴定,扩增纯化. pKC(700 bp片段含有BstX I位点)经BstX I酶切线性化后,利用T7RNA聚合酶进行体外转录^［4］.

1.6核酶转录及对靶RNA的剪切反应见文献［4］.

2结果

2.1核酶的计算机设计由于乙型肝炎病毒表达的核心抗原的功能比较明了,可参与HBV核衣壳的装配,与病毒的复制密切相关,因此我们选择C基因的序列作为核酶设计的靶序列. 根据计算机分析的结果显示:在104位(1942-1944 GUU),191位(2029-2031GUC).222位(2063-65 CUC)三个切点附近序列的二级结构较为理想, 我们将可切割三个位点的核酶分别称为Rz1, Rz2, Rz3. 三个切点的共同特征是其位于RNA二级结构的单链状区域内,从而使核酶的切点充分暴露出来,同时切点两端的二级结构对其影响较小,有利于核酶与底物分子结合,提高核酶的切割效率.

2.2pGEMRz123转录质粒的构建及转录酶切和测序结果表明构建的核酶基因序列与设计合成的序列完全一致.由此我们得到了可去除附加序列的核酶自剪切转录载体^［7］. pGEMRz123经T7RNA聚合酶体外转录,转录产物的放射自显影结果可见三个条带,分别为三个串联的Rz123 (150 nt), 5'顺式核酶(54 nt)和3'顺式核酶(54 nt), 表明设计的5'顺式核酶和3'顺式核酶发生了自剪切,并释放出三个串联的Rz123 (Fig 3).

2.3核酶(Rz1,Rz2和Rz3)及靶RNA转录质粒的构建及转录pGEMRz1, pGEMRz2, pGEMRz3质粒可由pGEMRz123经过不同酶切得到, 经Apa I, EcoR I; Apa I, Cla I;Apa I, BamH I酶切得到100 bp, 106 bp, 104 bp的片段,酶切鉴定质粒构建正确.上述质粒经体外转录自剪切去掉5-'顺式核酶(64 nt)^［7］,可产生50 nt, 56 nt, 54 nt的核苷酸片段.(结果未列出).

pKC质粒可转录出³²P标记的HBV C基因部分RNA片段,长度为267 nt, 可用于体外切割的靶基因.

图2pKC质粒的构建

fig 2Construction of the plasmid pKC

2.4单一核酶对靶RNA的切割作用将Rz1，Rz2，Rz3和靶RNA按分子比10∶1 37 ℃保温1 h,结果表明Rz1，Rz2，Rz3均能切割靶RNA, Rz1切割靶RNA可得到165 nt, 102 nt片段, Rz2得到189 nt, 78 nt 片段,Rz3得到223 nt和44 nt片段(44 nt片段小未观察到). 与理论预测值相一致;切割效率Rz1＞Rz2＞Rz3,与计算机预测结果一致(Fig 4).

2.5联合型核酶对靶RNA的切割如Fig 5所示,当将联合型核酶与底物混合后,底物分子可被核酶切割成不同片段, Rz123中Rz1,Rz2,Rz3不仅可单独作用,而且能联合切割,说明联合型核酶中的单一核酶保持了原有的特性,而且单一核酶可相互协同作用,即当Rz123共同作用时还可产生121 nt和87 nt片段(Fig 5).

图3pGEMRz质粒转录图

fig 3Self-cleavage map of the plasmid pGEMRz123 in vitro

3讨论

本研究成功地利用计算机设计了抗HBV C基因mRNA三个单一及串联核酶, 将抗HBV的单一及联合型核酶构建入带有顺式核酶的体外转录载体中.质粒经体外转录可释放出目的核酶,去除了核酶两侧长片段载体序列.体外观察了单一及串联核酶对乙型肝炎病毒C基因体外转录物的切割作用,同时研究结果表明联合型核酶不仅保持原有单一核酶的特异性,而且能相互协同,提高了核酶阻断基因表达的效率.

计算机设计核酶,选择核酶的切割点是一种目前较为经济,方便有效的手段, 但它很大程度上依赖于计算机软件的功能.我们采用的软件是经过实践不断修改而成的^［6］, 因此是比较有效的. 体外切割结果表明我们的设计是正确的.

根据计算机的设计, 我们合成了5'顺式核酶,目的核酶及3'顺式核酶基因, 并将它们构建入pGEMRz123中,该质粒体外转录得到了目的核酶分子. 计算机预测和实验结果表明,核酶两侧的少量碱基对核酶生物学活性没有明显影响,结果与文献一致^［3，8］. 陈桦等^［3］研究认为带有顺式核酶的目的核酶载体,在转录后不仅能有效自剪切, 而且顺式核酶对底物无特异切割作用,也不影响核酶对靶基因的作用.因此我们设计的核酶自剪切载体能确保目的核酶正确地发挥作用. 核酶自剪转录载体的设计具有广泛的应用价值. 由于目前所用的核酶载体导入细胞后产生的核酶,其两侧的长片段附加序列阻碍核酶与靶RNA结合, 同时核酶发挥作用不能很快与靶RNA解离,影响了核酶的切割效率, 因此引入自剪切核酶可去除附加序列的影响.

在我们的研究中,联合型核酶中的单一核酶能够独自发挥切割作用,而且能互相协同联合切割,因此提高了单一核酶的切割效率. 从抗病毒的整个意义上来讲,为最大限度地破坏病毒RNA, 多个核酶比单个核酶更为有效^［9，10］.每个核酶部分切割底物分子,而它们联合就有可能完全阻断基因表达.病毒在复制过程中有可能发生碱基突变或