第四军医大学学报1999年第20卷第9期

郑世曦李孝圭周利军蒋嵩山贺林朱兴族

摘要目的：构建pcDNA3/GDNF真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将GDNF逆转录聚合酶链式反应产物克隆至pcDNA3真核表达载体上，经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞，了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性.结果：酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3/GDNF表达质粒克隆成功，转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白.结论：以脂质体介导pcDNA3/GDNF质粒转染真核细胞有可能用于帕金森氏症的基因治疗.

关键词：胶质细胞源性神经营养因子真核细胞DNA,重组限制酶图谱法转染逆转录聚合酶链反应

0引言

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是新近发现的一种神经营养因子，它不仅对多巴胺能等中枢神经元具有营养及保护作用，而且还对其具有明显的修复作用，所以具有广泛的应用前景^［1］.我们应用RT－PCR构建了大鼠GDNF真核表达载体，并在真核细胞内表达出具有活性的蛋白，为今后深入研究该因子的作用打下了基础.

1材料和方法

1.1大鼠原代胶质细胞的培养及RNA的提取以大鼠原代胶质细胞总RNA为模板克隆GDNF真核表达载体.原代细胞的分离、培养按我室常规进行，以DMEM,100mL/LFCS培养.10⁷细胞经TRIzol(Gibco)试剂盒提取总RNA，以A_260nm/A_280nm比值及凝胶电泳鉴定其质量，确定其含量.

1.2引物设计及RT－PCR参考Lin等^［2］报道的GDNFcDNA序列设计其引物.正向引物为5′-GAA GGATCC ATGAAGTTATGGGATGTC-3′，反向引物为5′-GGC CTCGAG TTAGATACATCCACTCCG-3′.正向引物含有BamHⅠ酶切位点，反向引物含有XhoⅠ酶切位点，扩增目的片段长633bp.为增加翻译中止效果，中止密码改为TAA.引物经Beckman DNA合成仪合成，PAGE电泳纯化.RT－PCR过程按我室常规进行^［3］.10μL反应产物经10g/L琼脂糖电泳后，溴化乙啶染色初步观察条带大小.

1.3PCR产物的克隆及鉴定经低熔点胶回收的PCR产物拟克隆至pcDNA3真核表达载体(Invitrogen，USA)上.两者分别经HindⅢ/XhoⅠ(Promega,USA)双酶切37℃2h，再经低熔点胶回收，应用牛小肠碱性磷酸酶(MBI,Lithualia)将pcDNA3载体5′端脱磷酸化并经纯化后，经T4DNA连接酶(Promega)14℃连接16h(Fig1).连接产物转化感受态大肠杆菌E.ColiDH5α并筛选出氨苄青霉素抗性菌落.转化菌落小量扩增后经碱变性提取质粒DNA.

图1GDMF片段与pcDNA3载体连接

fig1Ligation of GDNF fragment to pcDNA3 vector

1.4重组体的鉴定质粒经BamHⅠ/XhoⅠ和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，8g/LPAGE后银染显色观察切下的片段大小.另同时经PE公司ABI自动测序仪进行序列分析.

1.5pcDNA3/GDNF转化胶质细胞大鼠胶质细胞作为pcDNA3/GDNF转染的靶细胞.5×10⁴细胞接种于6孔板内常规培养24h，换无血清DMEM.1μg(1μL)pcDNA3/GDNF质粒与3μg(3μL)DOSPER转染试剂(Boehringer Mannheim)混合于90μL无血清DMEM中，37℃20min后加入培养板，细胞经37℃培养24h(以pcDNA3空载体为阴性对照)后补足血清至终浓度为100mg/L，继续培养36h.细胞按1∶3传代并在培养基中加入600mg/LG418(Gibco/BRL)，3d后G418浓度降为200mg/L继续培养15d～20d以筛选出经质粒转染的胶质细胞.细胞经40g/L多聚甲醛固定，按常规进行GDNF免疫细胞化学染色^［3］.

1.6GDNF生物学活性鉴定为了解pcDNA3/GDNF质粒转染真核细胞表达出的GDNF的活性，按Suter-Crazzolara等^［4］方法了解它对大鼠胶质瘤细胞系(C6)生长的刺激作用.5×10⁴C6细胞在无血清培养基中培养24h后，按pcDNA3/GDNF：DOSPER比例为1μg：3μg(W/W)加入培养基24h后，补足血清继续培养48h，常规计数.

2结果

2.1RNA提取及RT－PCR细胞总RNA溶于适量TE，经8g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定出现明显的18S和28S两条带，A_260nm/A_280nm比值为1.90.RT－PCR产物为大约640bp特异片段，无明显非特异扩增带.

2.2pcDNA3/GDNF重组体鉴定结果在目的片段第101位氨基酸处有一EcoRⅠ酶切位点，经BamHⅠ/XhoⅠ和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后应分别出现640bp和300bp片段.经PAGE证实与预期的结果一致(Fig2).另外，测序结果与文献报道结果完全一致.

图2限制酶作用后重组pcDNA3/GDNF真核细胞表达载体电泳图

fig2Electrophoretic profile of recombinant pcDNA3/GDNF eukaryotic expression vector digested by restriction enzyme analysis(8g/L PAGE)

Marker λDNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ；pcDNA3/GDNF plasmid；pcDNA3 plasmid；pcDNA3/GDNF plasmid/BamH Ⅰ+XhoⅠ；pcDNA3/GDNF plasmid/BamH Ⅰ+EcoRⅠ；Marker pGEM-7Zf(+)/Hae；GDNF PCR product.

2.3pcDNA3/GDNF质粒在真核细胞中的表达GDNF免疫组化结果显示，正常胶质细胞内无免疫阳性反应，经转化的胶质细胞胞浆内可见棕黄色阳性反应，提示pcDNA3/GDNF质粒在胶质细胞内得到表达(Fig3)；此外，当大鼠胶质瘤细胞与pcDNA3/GDNF质粒共同培养后，细胞增殖数量较对照显著升高(103×10⁴vs80×10⁴,x±s,P＜0.05,n=4).此结果提示，GDNF蛋白能够刺激含多巴胺的神经细胞生长，pcDNA3/GDNF质粒能在细胞内表达出具有生物活性的蛋白.

图3转染胶质细胞中GDNF蛋白表达

fig3GDNF protein expression in transfected astrocytes

GDNF expression could not been seen in the normal astrocytes by immunocytochemistry,whereas the positive GDNF gain could be observed in the cytoplasm of the tranfectants.

3讨论

1993年Lin等^［2］从B49细胞将GDNF纯化并进行基因克隆，随后人们的研究表明：重组GDNF不仅有助于Parkinson病(PD)动物模型中脑细胞存活和分化，而且能明显减弱MPP^＋和6-OHDA对黑质纹状体中多巴胺能神经元的损伤作用.由于其作用特异性强，且在低浓度就能表现出很强的活性，故它可能成为治疗PD等神经退行性疾病的有效药物^［1］.目前的研究已证实，外源性GDNF能在生物体内发生作用，但因其昂贵，在脑组织中容易降解，外周给药又难以通过血脑屏障，故在一定程度上限制了其在临床上的广泛应用.随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们已经注意到应用基因治疗的方法治疗神经退行性疾病具有潜在的应用价值^［3］.Choi-Lundberg等^［6］以腺病毒为载体将GDNF转染细胞，发现它对6－OHDA诱导的黑质纹状体具有保护作用.尽管这种复制缺陷型病毒载体不具有毒性，但它能使机体产生免疫和炎症反应，从而影响治疗效果^［7］.裸质粒DNA因不具有抗原性，且纯化方便经济，若能提高其转染效率，它在神经系统的基因治疗具有诱人的前景^［7］.pcDNA3为一种真核表达载体，其5′端含CMV启动子，3′端polyA尾，能将克隆至其中的目的片断高效表达^［8］.另外，阳离子脂质体因其低毒性和高转染效率，已被认为是转染神经细胞的重要载体^［9］.我们构建了pcDNA3/GDNF真核表达载体，实验结果表明它能在真核细胞内表达出具有活性的GDNF蛋白，为我们下一步的研究打下了基础.

基金项目：香港王宽诚教育基金会资助项目

作者简介：郑世曦，男，1967-03-28生，湖北省武汉市人，汉族.1990年武汉同济医科大学临床医学系毕业，1997年同济医科大学病理学博士，现为中国科学院上海药物研究所神经药理研究室博士后，发表论文15篇.博士后导师为朱兴族.Tel：(21)64311833Ext309Fax:(21)64370269E-mailsxzheng @server.shcnc.ac.cn or sxzheng@hotmail.com

作者单位：（郑世曦周利军朱兴族）中国科学院上海生命科学研究中心：上海药物研究所；

（李孝圭蒋嵩山贺林）中国科学院上海生命科学研究中心：上海生理研究所，上海200031

参考文献

1 Lapchak PA, Gash DM, Collins F et al. Pharmacological activities of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) : preclinical development and application to the treatment of Parkinson′s disease. Exp Neurol, 1997; 14