第四军医大学学报1999年第20卷第7期

张菊颜真韩苇王俊楼赵永同赵宁张英起苏成芝

摘要目的:获得具有活性angiostatin的表达,为进一步开发应用奠定基础.方法:用PCR方法从人纤维蛋白酶原基因中,获得angiostatin(K1-3)的基因,用原核表达载体 pBV220, 表达非融合angiostatin(K1-3).结果:得到有抑制活性angiostatin(K1-3)的表达,但表达量较低.结论:angiostatin(K1-3)可在原核非融合蛋白表达载体中得到表达.

关键词:血管生成因子，拮抗剂和抑制剂基因表达内皮生长因子

0引言

新生血管在肿瘤发生发展及转移中的作用日益为人们所关注. 1995年,O′Reilly等^［1］在荷低转移Lewis肺癌鼠血清及尿液中发现angiostatin——一种同源于纤维蛋白酶原内片段的多肽,具有特异的抑制血管新生,抑制肿瘤生长、转移作用. 且动物实验显示几乎没有毒副作用、抗原性及耐受性. 该物质的发现对肿瘤,特别是其转移的治疗提示了一个新的途径. 据文献报道,angiostatin(K1-3)具有较高的生长抑制活性^［2］,其氨基酸序列98%以上同源于纤维蛋白酶原,相对分子质量较大,约38×10³,其体内来源尚不清楚，估计与体内某些蛋白酶的裂解功能有关，由于天然angiostatin数量有限，故为了获得大量持续来源的angiostatin,我们以人纤维蛋白酶原为模板, 设计了一对PCR引物,继真核表达后又将其在原核非融合蛋白表达载体pBV220中进行了表达.

1材料和方法

1.1材料限制性内切酶购自Gibco公司,T4 DNA连接酶,Western-blotting 试 剂盒,DNA纯化试剂盒购自Promega公司,PCR引物、dNTP,Taq-DNA聚合酶购自Sangon公司,lysine-sepharose 4B购自Pharmacia公司,6-氨基己酸, MTT 购自Sigma 公司,Plasminogen Kringle1-4单抗IgG购自American diagnosis 公司.靶细胞Balb/C 3T3胚胎细胞购自中国科学院细胞生物研究所. plasminogen cDNA由杨静华博士惠赠.

1.2方法

1.2.1PCR反应据文献报道纤维蛋白酶原及angiostatin(K1-3)序列, 设计PCR引物,为便于克隆测序及表达,两端分别引入适当酶切位点及表达起始、终止码^［3］.

P5 cg gaattc atg gct gaa aac agg aag tc

EcoR Ⅰ

P3 cg ggatcc tca ttg ttc cgt gga tac tgg gga

BamH Ⅰ

在0.5 mL无菌管中分别加入P5,P3各50 pmol,dNTP 200 μmol, 10×Buf 10 μL 纤维蛋白酶原cDNA模板0.1 μL,加无菌双蒸水至100 μL,Taq-DNA 酶 2.5 IU, 于 PTC-100 PCR仪反应,94℃ 5 min变性,94℃ 1 min,72℃ 1.5 min,共30个循环,72℃延伸10 min.

1.2.2构建pBS-Angio(K1-3)质粒将上述PCR片段及pBS质粒DNA分别经 EcoR Ⅰ , BamH Ⅰ酶切后,连接,转化,经α-插入互补蓝白筛选,挑取重组克隆培养,提取DNA,酶切鉴定后,测序确定正确克隆.

1.2.3构建pBV220-Angio(K1-3)表达载体采用非融合,高表达且操作简单的pBV220载体进行表达. 正确重组pBS-Angio(K1-3)质粒DNA,pBV220质粒DNA分别经 EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ酶切,回收angio(K1-3)DNA片段,连接,转化DH5α菌,挑选重组克隆培养, 提取DNA,EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ和Pst Ⅰ酶切,鉴定正确重组克隆.

1.2.4Angiostatin(K1-3)的表达正确重组pBV220-Angio(K1-3)/DH5α菌,30℃ 活化摇过夜,以1∶100比例接种LB(Amp^R)培养基,30℃继续培养4 h后,迅速升温至 42℃,培养4 h～6 h,用Bio-Rad垂直平板电泳仪及Mini-trans转移仪做 SDS-PAGE 及 Western blotting,检测表达.

1.2.5Angiostatin(K1-3)的纯化因plasminogen Kring区对赖氨酸及6-氨基己酸有亲和性^［4］,采用lysine-sepharose 4B纯化. 800 r/min离心 10 min,收集细胞, 据文献［5］方法裂解,细胞裂解上清经500 mL/L(NH₄)₂SO₄沉淀,对50 mmol/L,pH 7.5 磷酸盐缓冲液透析平衡后上柱,再用透析平衡液及含0.5 mol/L NaCl的透析平衡液洗脱后, 最后用6-氨基己酸特异洗脱,得到angiostatin纯品.

1.2.6生物学活性的体外检测先采用Lowry法测定蛋白含量. 再用鸡胚绒毛膜尿囊膜分析(CAM),检测血管生长抑制因子^［1］. 取6 d龄的鸡胚, 注入表达蛋白纯化产物20 μg/只～60μg/只,39℃孵育48 h后,打开鸡胚,观察绒毛膜尿囊膜血管增生情况.

因angiostatin特异的抑制内皮细胞生长活性, 采用 MTT 方法, 以内皮源性Balb/C 3T3胚胎细胞作为靶细胞,检测表达蛋白的生长抑制活性. 接种细胞10³/ 孔于96孔板,37℃ 50 mL/L CO₂ 4 h～6 h贴壁后,弃上清, 加入含对照及不同浓度表达蛋白纯品的100 mL/L FCS RPMI 1640 200 μL/孔,60 h后,加入MTT( 5 g/L)20 μL/孔, 继续孵育4 h,小心吸弃上清,加入DMSO 150 μL/孔,充分振荡10 h后,在Bio-Rad 450 Microplate酶标仪上于490 nm读数,计算IC50为:8 mg/L.

2 结果

2.1获得angiostatin(K1-3)基因片段PCR 产物电泳片段大小(Fig 1), pBS-Angio(K1-3)质粒DNA经EcoRⅠ, BamHⅠ酶切后所得片段大小与预期相符, 为858 bp. 序列测定表明所得DNA片段为目的基因.

1Angiostation(K1-3)片段PCR反应结果

fig 1Identification angiostation(K1-3) DNA of PCR

A: PCR Marker； B: DNA of PCR.

2.2pBV220-Angio(K1-3)表达载体的鉴定该质粒DNA经EcoRⅠ,BamHⅠ 酶切得到片段大小恰好为插入片段,经PstⅠ酶切,分别得到3片段大小与序列分析结果相一致(Fig 2).

2pBV-Angio(K1-3)的酶切鉴定

fig 2Identification of pBV-Angio(K1-3)

A:λDNA/HindⅢ marker;B:BamHⅠ+EcoRⅠ;C:PstⅠ; D:PUC/TaqⅠ marker.

2.3Angiostatin表达的鉴定angiostatin(K1-3) 的相对分子质量为41 700. 可见pBV220-Angio(K1-3)在42℃诱导时,在相应分子质量处有一浓染表达带, 随时间不同,表达量不同,以4 h～6 h达最高(Fig 3).

图 3Angiostatin(K1-3)表达的SDS-PAGE鉴定

fig 3Identification of expression by SDS-PAGE

2.4Angiostatin的纯化纯化后,SDS-PAGE在相应分子质量位置得到1条纯化带,取该品1 mL浓缩后,做Westem-blotting,可见相应位置有1条特异着色带(Fig 4).

图 4Angio(K1-3) 表达的Western-blot鉴定

Fig 4Identification of angio(K1-3) by Western-blot

2.5Angiostatin的体外抑制内皮细胞生长活性CAM试验中,可见用药组血管增生较单纯用洗脱液组有显著减弱(Fig 5). MTT法检测angiostatin对Balb/C 3T3胚胎细胞的生长,呈剂量依赖性抑制,IC50为8 mg/L,但未达到完全抑制. 提高剂量没有表现显著的杀伤作用，未见明显的瓶内贴壁细胞漂浮死亡现象（Fig 6）.

图 5Angiostatin的鸡胚绒毛膜尿囊膜试验

fig 5The chickembryo chonoallantoic membrane assay of angiostatin

A: Control; B: Test.

图 6Angiostatin对Balb/c 3T3胚胎细胞的生长抑制活性 （对照组的%）

Fig 6Inhibitive effect of angiostatin on survival rate of Balb/c 3T3 embryo cell

3讨论

肿瘤在体内的生存,生长及转移依赖于其瘤灶局部血管新生以提供营养. 故目前对于肿瘤的治疗,一方面是直接杀伤肿瘤细胞如放疗、化疗及手术切除,另一方面就是阻断其血流, 营养供应, 如目前方兴未艾的介入放射治疗. 表达angiostatin,旨在寻找一种能有效阻断肿瘤血液供应的生物疗法,我们采用曾高效表达了干扰素,TNF等基因的原核高效表达载体pBV220将angiostatin(K1-3)进行了表达,体内实验证明angiostatin可以在原核表达系统中得到有活性的表达. 但是如何能得到高