第二军医大学学报1999年第20卷第10期

潘卫戚中田

摘要目的：构建适用于外源性随机多肽的噬菌体展示载体。方法：在引物中加入XbaⅠ识别序列，将用该引物扩增的PCR产物克隆到pGEM-T中，再将该片段插入pCANTAB5E中构建成噬菌体展示载体pCANTAB5X。结果：限制酶切点XbaⅠ和HGV C片段被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5X中。结论：构建的新的噬菌体展示载体pCANTAB5X能有效展示外源性随机多肽。

关键词：噬菌体展示载体

噬菌体展示技术是研究生物活性分子间相互作用的新技术^［1］。 各种类型的外源分子已在噬菌体表面得到成功的展示^［2～4］。 然而，现使用的噬菌体展示载体的克隆位点不理想，往往是较为稀有、酶切效率不高的限制酶酶切位点， 这对构建外源性随机肽库的效率起了限制作用。 本研究在噬菌体展示载体中引入了常用的限制酶克隆位点，构建成能有效展示外源性随机肽的展示载体pCANTAB5X。

1材料和方法

1.1质粒载体和细菌株重组噬菌体抗体表达试剂盒为Amersham pharmacia biotech公司产品(Code No.27-9401-01)，其中包括噬菌粒 pCANTAB5E表达载体（用SfiⅠ, NotⅠ预切过）。 HGV cDNA克隆质粒pHGVqz 由本室提供, 其中包括HGV全长cDNA序列^［5］。质粒pGEM-T试剂盒购自Promega公司。大肠杆菌DH5α，TG1为本室保存。

1.2引物序列用于引入XbaⅠ位点及扩增HGV C片段的上游引物PSFⅠ：5′-GCGGCCCAGCCGGCCTCTAGAAATGCATGGGG-3′，引入XbaⅠ 酶切位点（-TCTAGA-）和SfiⅠ位点（-GGCCCAGCCGGCC-），下游引物PNOTⅠ：5′-AGGCGGCCGC TCTAGA ACCCAATATC- 3′， 引入XbaⅠ 酶切位点（-TCTAGA-）和NotⅠ位点（-GCGGCCGC-）。上游测序引物PCANTAB5-S1：5′-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC- 3′，下游测序引物序列为 PCANTAB5-S6：5′-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG- 3′。

1.3工具酶Taq酶、限制酶、碱性磷酸酶、连接酶均为Gibco BRL产品。

1.4HGV C片段的PCR扩增与克隆用PSFⅠ及PNOTⅠ以pHGVqz为模板扩增HGV C基因片段。取纯化的PCR产物500 ng与500 ng pGEM-T载体连接。转化JM109钙化菌。提取重组质粒DNA，XbaⅠ酶切鉴定重组子。

1.5重组噬菌体展示载体pCANTAB5X的构建克隆到pGEM-T质粒上的HGV C片段用限制酶SfiⅠ及NotⅠ酶切，分离250 bp左右的小片段与经SfiⅠ, NotⅠ预切的pCANTAB-5E连接，转化TG₁钙化菌，提取质粒DNA，XbaⅠ, SfiⅠ, NotⅠ酶切鉴定重组子。

1.6pCANTAB5X DNA序列测定阳性克隆重组质粒用DNA抽提试剂盒纯化。采用PCR方法进行DNA序列测定，测序引物为pCANTAB5E克隆位点上游和下游引物。所测序列用DNASIS软件进行序列比较分析。

1.7重组噬菌体展示载体pCANTAB5X的展示应用pCANTAB5X用XbaⅠ酶切，分离载体片段，碱性磷酸酶处理， 与用PCR方法制备经XbaⅠ酶切的HCV核心蛋白随机DNA连接， 转化大肠杆菌TG1，重组细菌用载体上、下游引物进行PCR扩增，检测插入片段的大小。

2结果

2.1HGV核心片段的PCR扩增用于HGV核心片段（HGC259）的PCR扩增的上游引物PSFI序列相应于HGV IW株^［5］ 核苷酸序列的435位，上游还带有19个碱基的SfiⅠ和XbaⅠ的限制酶识别序列，下游引物PNOTⅠ相应于HGV序列661位，下游还带有13个碱基的XbaⅠ和NotⅠ识别序列。这样理论上的扩增片段大小应为259 bp。扩增片段电泳后与 pGEM-7Z(+1)/HaeⅢ DNA分子质量标记比较，确在260 bp左右，符合理论值。

2.2HGV核心片段（HGC 259）的克隆用试剂盒纯化HGC 259扩增片段，将其克隆到质粒pGEM-T中。二者连接转化后挑6个转化子扩增细菌，提取质粒DNA，用XbaⅠ酶切鉴定重组子，结果如图1所示，6个克隆中有5个含有插入片段，插入片段大小应为231 bp左右，实际电泳结果比扩增片段略小，符合理论预计值。

1HGV 片段pGEM-T-HGC-C克隆的XbaⅠ酶切鉴定

Fig 1Digestion of pGEM-T-HGC-C with XbaⅠ

Lane 1～6: Clone 1～6; Lane 7: HGV C

fragment; Lane 8:PCR marker

2.3噬菌粒pCANTAB5X构建用限制酶SfiⅠ和NotⅠ将HGC 259片段从pGEM-T质粒上切出。低熔点胶回收小片段（分子质量230 bp左右），直接与重组噬菌体抗体表达系统试剂盒中提供的、已预先用SfiⅠ和NotⅠ切好的噬菌粒载体pCANTAB5E连接。转化大肠杆菌TG1，挑6个重组子用限制酶NotⅠ, XbaⅠ和SfiⅠ筛选鉴定，结果见图2，6个重组子酶切带型均一致，酶切结果符合理论预计值。

2pCANTAB5X的酶切鉴定

fig 2Digestion of pCANTAB5X with NotⅠ,

XbaⅠ and SfiⅠ

Lane 1～6: Clone 1～6 digested with NotⅠ; Lane 7: Control plasmid DNA; Lane 8:λDNA/HindⅢ +EcoRⅠ marker; Lane 9～14:Clone 1～6 digested with XbaⅠ; Lane 15～20: Clone 1～6 digested with SfiⅠ

2.4pCANTAB5X插入区域的序列分析结果对噬菌粒pCANTAB5X插入部位进行了DNA序列分析。为了明确插入序列接头处的序列，在pCANTAB5E克隆位点SfiⅠ序列上游28 bp处合成了上游测序引物PCANTAB5-S1；在pCANTAB-5E琥珀酸突变终止子下游合成了测序引物PCANTAB5-S6。分别用上、下游引物测定pCANTAB5X中的插入序列及周围序列。二者测定结果经计算机分析比较表明其重叠区域完全一样。这样pCANTAB5X的插入序列及周围DNA序列完全肯定。

2.5pCANTAB5X的应用将PCR方法制备的HCV核心蛋白随机DNA，克隆到pCANTAB5X的XbaⅠ位点， 用克隆位点两侧的引物扩增克隆片段，结果见图3， 各种大小不一的随机DNA片段被克隆到了pCANTAB5X载体中。 这些插入片段经杂交证实为HCV核心序列（结果未示）。表明该载体有效地展示了外源随机DNA。

3pCANTAB5X展示的HCV随机片段的PCR检测

fig 3PCR detection of cloned HCV C

random DNA in pCANTAB5X

Lane 1: PCR marker; Lane 2: HCV core DNA;

Lane 3～10: Clone 1～8

3讨论

自从Smith^［1］ 首次将外源性蛋白展示于噬菌体表面以来，该技术被不断完善，已成为研究生物活性分子的重要方法之一。目前除了生物活性分子蛋白质、激素、细胞因子、酶和病毒蛋白等被成功地展示于噬菌体表面外，多种多样的噬菌体库已被构建成功，如随机肽库^［6］、cDNA文库^［7］、基因文库^［8］和抗体库^［9］等。近来一些病毒蛋白及天然蛋白的随机肽噬菌体展示库也被构建成功。然而，这样的随机肽库的构建对噬菌粒的克隆位点要求更高，需要常用的限制酶位点，酶切效率要高，克隆效果要好。而目前现成的展示载体并不能很好地满足这一要求，如BioLab提供载体（M13KE）克隆位点是ACC651和EagⅠ等。Pharmacia 公司提供的pCANTAB5E 是用于展示抗体库的噬菌粒载体，所用的克隆位点是SfiⅠ和NotⅠ。这些位点都不是常用位点。当利用这些位点进行随机肽基因库克隆时，由于在基因操作过程中的不便，往往最终的结果不尽如人意，而影响到克隆效率及库的容量。当使用常用的限制酶位点XbaⅠ进行随机DNA的克隆时，其操作过程得以简化，有利于提高克隆效率，增大库容量。

分别使用上、下游测序引物测定了引入pCANTAB5X的DNA序列，两个测序结果的比较表明，引入的序列完全正确，XbaⅠ切点和原载体的序列均完全正确；酶谱分析的结果也证实了这一点。新的展示载体pCANTAB5X可以用XbaⅠ单酶位点展示外源性随机肽库，这一位点是位于噬菌体PⅢ蛋白的N端和信号肽序列的C端之间，所展示的外源蛋白是以融合蛋白的形式展示在PⅢ的N端，因此用单酶位点所克隆的随机DNA库中只有1/6的序列被正确地展示出来。然而这一展示系统是否实用是应用中的最大问题。

我们利用这一XbaⅠ位点成功地展示了HCV核心蛋白的随机DNA，构建成功了噬菌体库，用抗 HCV血清对库进行了选择，获得了阳性克隆，阳性克隆的序列分析证明了外源蛋白以正确的读框得到了展示（结果未示）。说明了这一新的噬菌粒展示载体达到了设计要求，能够正确、方便、有效地展示随机DNA库，具有广阔的应用前景。

文章编号：0258-879X(1999)10-0723-03