第二军医大学学报1999年第20卷第10期

徐卫东侯铁胜张春才胡惠民毛积芳颜永碧

摘要目的：观察成纤维细胞生长因子（FGF）对培养兔关节软骨细胞基质及转化生长因子β₁（TGFβ₁）表达的影响。方法：培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞，在每次换液时加入FGF 100 ng/ml，铺满后收集细胞，作关节软骨细胞TGFβ₁检测及电镜免疫组织化学观察。采用氯胺T法和Antonopoulos法，作细胞基质的胶原和蛋白多糖含量测定。结果：FGF能明显促进胶原和蛋白多糖的合成，并且与剂量、时间呈正相关（P＜0.01）。光镜下实验组细胞明显呈棕色，电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒粘附。结论：FGF能促进关节软骨细胞TGFβ₁的表达及基质合成，推迟了关节软骨细胞的成熟，维持细胞的软骨表现型，这些作用有利于关节软骨损伤后的修复，可能具有一定的临床意义。

关键词：关节软骨细胞转化生长因子β₁成纤维细胞生长因子细胞基质

关节软骨的损伤与修复是目前骨科临床基础研究的一个重要课题。关节软骨损伤后的修复是极其有限的^［1］。许多多肽生长因子在关节软骨损伤与修复中起着重要的调节作用，如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF)对中胚层来源的细胞包括软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用^［2］。本研究培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞，作关节软骨细胞转化生长因子β₁(TGFβ₁)免疫组织化学研究，以了解生长因子对软骨细胞的作用。

1材料和方法

1.1材料专用微波炉、TGFβ₁ 抗体（美国 NIH Roche教授惠赠，3.5 μl抗体中和4 ng TGFβ），WAK-STP试剂盒，H-8000电镜、戊二醛、SPA-胶金、Epon 812包埋剂。1月龄新西兰兔由上海医科大学实验动物中心提供，共14只，均为雄性。FGF由第二军医大学基础医学部生化教研室姜关祥、胡惠民教授等按照Gospodarowicz方法^［3］，由牛脑中提取、纯化，为混合性。

1.2方法

1.2.1细胞培养1月龄新西兰兔，无菌取关节软骨，用PBS漂洗后，剪碎成1～2 mm见方，用0.125%胰蛋白酶消化25 min（置培养箱），离心1 000 r/min，5 min，弃上清，DMEM洗3次，用无血清培养液加0.06%Ⅱ型胶原酶，置37℃，5％ CO₂孵箱，消化10 h。尼龙布网过滤，收集细胞，用DMEM洗3次，加10％胎牛血清及DMEM培养液，制成细胞悬液，细胞浓度为(1～3)×10³个/ml，置于六孔培养板，每孔加细胞悬液3 ml，隔天换液。按以上方法，随机将15只兔分为2组（第1组10只，第2组5只），从第1组的每只兔关节软骨分离培养的细胞悬液制成4份，分别为胶原实验组及对照组和蛋白多糖实验组及对照组；同样，从第2组的每只兔关节软骨分离培养的细胞悬液制成4份，为免疫组化ABC染色实验组及对照组和免疫电镜实验组及对照组。

1.2.2细胞基质胶原含量测定氯胺T法：收集细胞悬液约2 ml，加入带盖试管中，加浓盐酸1.2 ml，110℃烘箱中水解7 h，加40％ NaOH 1.2 ml，加水稀释至10 ml，以1 mol/L HCl，4％ NaOH调pH值至6。3 000 r/min离心10 min，取上清液1 ml，加水1 ml，0.05 mol/L氯胺T 1.0 ml混匀。25℃水浴，充分振荡2次，加1 ml过氯酸，混匀，置5 min，加10％对二甲氨基苯甲醛1 ml，混匀，60℃水浴20 min。冷却后，用721型分光光度计，在560 nm处比色，读D值。以羟脯氨酸标准液作标准曲线，得出样品中羟脯氨酸的含量(×7.46即为胶原含量）。

1.2.3细胞基质蛋白多糖含量测定Antonopoulos法^［4］：取细胞悬液1 ml，放于消化管中，加4 mol/L HCl 0.5 ml，生理盐水0.5 ml，置于烤箱，110℃水解8 h，调pH值至6，加水10 ml，过滤。取滤液0.2 ml，加水0.4 ml，2 mol/L碳酸钠0.4 ml，2%乙酰丙酮0.5 ml，充分混匀，沸水煮20 min，冷却，加无水乙醇1 ml，Ehr氏试剂0.5 ml，混匀充分。以721型分光光度计在530 nm处比色，读D值。用标准N-乙酰葡萄糖胺溶液作标准曲线，得出样品中蛋白多糖的含量。

1.2.4免疫组化ABC法染色关节软骨细胞经原代培养铺满后，吸除培养液，用0.25%胰蛋白酶与0.01%EDTA 1∶2消化1 min，离心1 000 r/min，5 min后收集细胞，以PBS洗涤2次，再以微量PBS重悬细胞后，作细胞涂片，用4％多聚甲醛固定20 min，PBS洗3×3 min，吹干后加血清，10 min。加一抗微波处理50 s，放置10 min，再用PBS洗3×3 min；二抗微波处理50 s，放置5 min，PBS洗3×3 min，HRP标记卵白素微波处理50 s，放置5 min。DAB 30 ml＋0.3%双氧水50 μl显色10 min，蒸馏水稍洗后，用苏木素衬染1 min，脱水，透明，封片，镜检。

1.2.5SPA-胶金标记免疫电镜研究^［5］同上收集关节软骨细胞，PBS漂洗后用1.25%戊二醛微波固定5～20 s。漂洗后用TGFβ₁抗体振荡孵育60 min，35℃，PBS漂洗后用SPA-胶金振荡孵育60 min，35℃，PBS洗后再用2%戊二醛固定30～60 min，即可用血浆将标本凝成块状。上述标本在凝成块状之前均离心，凝成块后按常规电镜标本制备方法，Epon812包埋，超薄切片用醛酸铀、枸橼酸铅染色后即可在电镜下观察。

1.3统计学处理数据以X±S表示，组间以t检验进行差异显著性检测。

2结果

2.1FGF明显促进胶原的合成将FGF以倍比稀释成12.5，25，50，100和200 ng/ml，在每次隔天换液时分别加入5组细胞培养液，共加6次，于第12天收集细胞悬液。以FGF50 ng/ml于细胞换液时加入另5组细胞培养液， 于细胞培养第4，6，8，10和12天依次收集每组细胞悬液。对照组不加FGF。 作羟脯氨酸含量检测， 结果显示FGF能明显促进胶原的合成， 并且与剂量、时间呈正相关(图1A，1B)。

1FGF促进胶原合成的剂量效应关系(A)和时间效应关系(B)

fig 1The relation of dose-effect (A) and time-effect (B) on FGF promoting synthesis of collegen

^**P＜0.01 vs 0 ng/ml; (B)□:Control; ●: FGF 100 ng/ml; ^△△P＜0.01 vs control group

2.2FGF明显促进蛋白多糖的合成同2.1方法，结果显示FGF能明显促进蛋白多糖的合成，并且与剂量、时间呈正相关(图2A，2B)。

图2FGF促进蛋白多糖合成的剂量效应关系(A)和时间效应关系(B)

fig 2The relation of dose-effect (A) and time-effect (B) on FGF promoting synthesis of proteoglycan

^*P＜0.05,^**P＜0.01 vs 0 ng/ml; (B)□:Control; ●: FGF 100 ng/ml; ^△P＜0.05, ^△△P＜0.01 vs control group

2.3免疫组化检测结果实验中将FGF 100 ng/ml换液时加入细胞培养液，隔天换液，共加FGF6次，结果显示实验组细胞明显呈棕色，而对照组则棕色不明显或呈阴性(图3)，说明FGF明显促进TGFβ₁的合成。

3免疫组化ABC法检测结果(×3.3×100×2.5)

fig 3Immunohistochamical stainine of ABC show

(×3.3×100×2.5)

A: Contrast cells no brown;

B: Studied cells brown obviously

2.4免疫组化电镜观察结果显示实验组细胞膜表面有明显的胶金颗粒粘附，而对照组则较少(图4)。结果表明FGF能促进TGFβ₁的合成，而且显示TGFβ₁定位于关节软骨细胞膜表面。

图4免疫组化电镜观察结果(醛酸铀、枸橼酸铅染色，A×60 000×2.5)

fig 4Immunohistochmical of electron

microscope show (A×60 000×2.5)

a: Contrast cells adhesion less grains of

colloid-gold; B: Studied cells adhesion more

colloid-gold grains

3讨论

FGF对软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用，在软骨的生长、发育、分化、骨化过程中有重要的调节作用。

软骨组织通过软骨细胞肥大、透明、成熟以及钙质沉积而骨化。这对骨骼的发育、生