【摘要】目的:研究应激对即刻早期基因c-fos表达的调节作用及其与CRFmRNA、HPA通路和行为之间的关系。方法:制造社会应激动物模型,高架十字迷宫和空场实验评估大鼠应激后行为,免疫组织化学技术检测FOS蛋白表达,计算机图像分析系统定量,原位杂交检测CRFmRNA表达,放射免疫分析方法和酶联免疫吸附方法(ELISA)检测血清ACTH和Cortisol。结果:提示室旁核(PVN)部位的c-fos,可能作为第三信使调节促皮质激素释放激素(CRF)的表达,进而控制皮质激素释放激素(ACTH)的分泌,启动HPA轴,影响与应激有关的行为、神经内分泌免疫活动。

Effects of stress on Immediate Early Gene c-fos Expression and

HPA Axle Regulation in Rats

Lu Xiaohong,Li Lingjiang,Li Changqi et al.

(Institute of Mental Health,the Second Af filiated Hospital of Hunan Medical University

Changsha,Hunan Province,China 410011)

【Abstract】Objective:to investigate the regulatory mechanism of stress on expression of immediate early gene c-fos and the relation to CRFmRNA,HPA pathway and behavior in rats.Method:anxiety was induced in rats by a social defeat paradigm and assessed immediately by exposure to the cross maze and open field test.The expression of protein product of c-fos was examined by immunochemical technique in different brain regions and quantified by computer assisted image analyzing system.In situ hybridization was used to detect the expression of CRHmRNA.Serum ACTH and cortisol were analyzed by RIA and ELISA.Results:there are significant behavior changes in the social defeated rats showed by cross maze and open field test.The protein product of c-fos was significantly expressed in PVN and amygdala compared to control group(p＜0.001).The expression of CRFmRNA was also located in PVN.Serum cortisol was elevated significantly(p＜0.05)and serum ACTH was elevated without significance.Conclusion:c-fos in the PVN may be involved in the expression of CRF as third messenger and thereby control the excretion of ACTH,activate the HPA axle and affect the behavior and neuro-endocrine-immune activity related to stress.

【Key words】stress c-fos HPA CRFmRNA

心理应激是个体“察觉”环境对生理心理及社会功能系统造成负担时的整体现象,所起的反应可以是适应的或适应不良的。最近发现一对关系密切的原癌基因(proto-oncogens)c-fos/c-jun在中枢神经网路上,可由于心理应激等活动而立即、及时地进行转录,一过性地表达转译为Fos/Jun核蛋白,然后返回核内参与组成对其它靶基因转录调节的“转录因子”(tran-scriptive factors)。这类原癌基因被称为“即刻早期基因”(IEG，immediate early genes)^［1］。但目前对即刻早期基因究竟在心理应激中扮演什么角色以及其与经典的应激通路下丘脑－垂体－肾上腺轴(HPA)的关系尚不清楚。

本研究通过制造社会失败(social defeat)应激动物模型,以研究应激对即刻早期基因c-fos表达的调节作用及其与CRFmRNA,HPA通路和行为之间的关系。

材料与方法

一、社会应激动物模型与行为评估

1.模型:雄性Sprague-Dawley大鼠(中国科学院上海实验动物中心),体重200－300g,社会应激模型基本按照Miscek的方法,雄性大鼠长期单独饲养。实验开始时,将实验组大鼠放入单独饲养大鼠笼中,单独饲养鼠会攻击实验鼠,撒咬侵入者的颈部与背部。在第一次攻击发生后实验持续8分钟,允许10分钟作为攻击潜伏期。社会失败(social defeat)的定义是:实验大鼠至少受到一次攻击,并且表现出驯服的姿势,如防御性直立,仰卧,静止不动等。

2.行为测验:a.反映焦虑情绪的高架十字迷宫(plus maze):高架十字迷宫包括两条开放臂(50×10cm)和两条闭合臂(50×10×40cm),由中央区(10×10cm)联结,室内为暗光(80lux)。实验过程伴白噪声。单盲,二位观察者分别观察每组50%的动物。大鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫,记录5分钟内活动的情况,观察指标:(1)闭合臂进入次数(必须有两只前爪进入臂内);(2)开放臂进入次数;(3)闭合臂停留时间;(4)开放臂停留时间。b.反映探究活动及情绪反应的空场实验(open field method):木制箱100×100×50cm,地板用笔划成25方格20×20cm,沿墙格称外周格,其余为中央格。将动物放在正中央格,观察12分钟内活动情况。观察指标(1)方格间穿行次数:三爪以上跨入邻格的次数;(2)竖起或修饰次数:两前肢离地1cm以上的次数;(3)中央格停留时间。

二、主要实验方法

(一)免疫组化:主要试剂:Ⅰ抗:兔多克隆fos抗体(由美国Santa Cruz Biotech生产),fos抗体的特异性已被检验过,用过量的纯化fos蛋白与此抗体混匀后,用混合液做免疫染色,在阳性组织切片上结果为阴性。Ⅱ抗、Ⅲ抗:Dako公司ABC试剂盒。DAB(Sigma)。

(二)方法:A灌注与取材:各组动物分别于应激后1小时,腹腔内注射戊巴比妥钠(60mg/kg)深度麻醉后,打开胸腔,经心主动脉插入导管,先用0.9%生理盐水灌洗(压力为100-120mmHg),再用新鲜配制的4%多聚甲醛(0.1M,PH值7.4)300ml,以先快后慢的原则灌注固定20分钟,取材后浸入30%蔗糖PBS(PH7.2)至脑组织下沉,AO切片机30μm连续冠状切片^［2］。B免疫组化反应步骤:脑片在PB中漂洗3次,然后在1.5%正常封闭血清中孵育20分钟抑制非特异性IgG,PB漂洗5×5min,含兔抗fos多克隆抗体(1∶5000)4℃过夜,PB漂洗5×5min,生物素化二抗在1∶100的PB中室温下反应1hr,PB漂洗5×5min,ABC液1∶10室温反应1hr,PB漂洗2×10min,用0.5%的TritonX-100/PBS洗30秒,在0.05%DAB,0.01%H₂O₂的TB中反应约10min显色,显微镜下控制,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。

C对照实验:用NGS和PB分别取代一抗和二抗做免疫组化,其余步骤同上。

(三)原位杂交

1.材料与试剂:DIG3′端标记试剂盒和DIG检测试剂盒均购自德国Boehringer Mannheim公司,CRFmRNA寡核苷酸探针由美国Cybersyn公司合成,序列为：5′-CAGTTTCCTGTTGCTGTGAG-

CTTGCTGAGCTAACTGCTCTGCCCTGGA-3′,经过GenBank同源序列检索。

2.寡核苷酸3′端标记步骤以及原位杂交步骤参照德国Boehringer Mannheim公司方法^［3］。

(四)内分泌激素测定:1放射免疫分析方法(RIA)检测血浆ACTH:RIA试剂盒由DPC公司提供2.酶联免疫吸附方法(ELISA)检测血清Cortisol:Cortisol试剂盒(ELISA)由BIODATA公司提供。

资料处理:用Olympus显微镜观察并照相,免疫组化结果通过计算机图像分析系统(MIAS300),分别测出各组FLI数密度。实验结果用SPSS 8.0 for windows95统计软件分析,均用均数±标准差(±SD)表示。多个样本均数比较用单因素方差分析,两组间均数的比较采用独立样本t检验,显著性水平p＜0.05。

结果

一、社会应激后大鼠行为改变

(一)高架十字迷宫行为:应激组(n=12,7.4±4.6)与对照组(n=8,32.3±17.8)比较显著减少了大鼠在高架十字迷宫开放臂停留的时间(用开放臂时间占两种臂进入时间总和的百分比来表示,p＜0.001)。应激组(n=12,17.8±9.5)与对照组(n=8,39.7±27.5)比较显著减少了大鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数(用开放臂进入次数占两种臂进入次数总和的百分比来表示,p＜0.05)。说明社会失败(social defeat)具有明显的产生应激后焦虑行为的作用。应激组(n=12,6.2±4.9)与对照组(n=8,7.1±4.6)大鼠总活动(overall activity,开放臂进入次数与闭合臂进入次数之和)差异无显著性(p＞0.05)。

(二)空场实验:应激组(n=12,23.5±12.7)与对照组(n=8,41.3±27.0)比较,显著减少了12分钟内大鼠方格间穿行次数(三爪以上跨入邻格的次数,p＜0.05),应激组(n=12,25.5±16.4)与对照组(n=8,17.1±9.7)大鼠竖起修饰次数差异有显著性(两前肢离地1cm以上的次数,p＜0.05)。中央格内停留时间,应激组(n=12,8.3±5.6)对照组(n=8,13.1±4.6)差异无显著性(p＞0.05)。

二、社会应激对大鼠室旁核、杏仁核、皮质部位FOS蛋白的作用:

光镜下观察,应激组FOS蛋白免疫反应物质呈蓝黑色颗粒状(硫酸镍铵加强法),位于神经细胞核内。以下丘脑室旁核(PVN)部位最为密集,未用硫酸镍铵加强则呈棕黄色。杏仁核、皮质部位均有较强的FOS蛋白表达,但弱于PVN。未应激空白对照组偶见零星的c-fos表达。抗体替换试验组未见阳性产物。用MIAS-300计算机图像分析系统在PVN和杏仁核部位随机取4-6个单位面积(134.553um²)计算FOS蛋白免疫反应物质的数密度,统计学分析,应激组与空白对照组比较,应激组下丘脑室旁核(54.0±9.4)与杏仁核(14.9±4.6)部位的FOS蛋白免疫反应物质与空白对照组下丘脑室旁核(4.2±1.8)与杏仁核(2.7±1.1)的数密度差异<