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【摘要】目的观察丙酮酸对急性阻塞性肠缺血再灌注(I/R)的影响。方法50只Wistar大鼠（幼龄40只和成年10只）分为5组：手术对照组、缺血组、再灌注组、丙酮酸组、成年动物再灌注组。在60min缺血和120min再灌注后，进行生化和组织病理学检测。结果缺血组血清谷丙转氨酶(ALT)值和肠粘膜损害较手术对照组明显升高(P＜0.05)，超氧化物岐化酶(SOD)活性无明显变化；再灌注组血清ALT值明显升高，SOD活性明显减低，肠粘膜评分为3.95±0.69，与手术对照组和缺血组相比较差异均有显著性(P＜0.01)；丙酮酸组ALT值、SOD活性和肠粘膜评分与再灌注组相比均有明显改善(P＜0.01)；幼龄再灌注组ALT值和肠粘膜评分均明显高于成年动物再灌注组(P＜0.05)。结论幼鼠肠缺血可以引起肠粘膜和肝脏功能损伤，再灌注则加重这种损伤并导致肠、肝、肺组织病理形态学改变，其机制与再灌注时氧自由基大量产生有关。丙酮酸可以减轻再灌注损伤；在相同条件下，幼龄动物比成年动物对肠I/R更为敏感。
Effect of pyruvate in intestinal ischemia-reperfusion injury
HAN Xin, XIAO Fuda, YU Ming
（Department of Pediatric Surgery, 2nd Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003,China）
【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of pyruvate on intestinal ischemia-reperfusion injury using immature rat model.MethodsFifty Wistar rats (40 immature rats and 10 adult rats) were divided into 5 groups: 1)control group (sham operated, n=10), 2) ischemia group (60 minutes of superior mesenteric artery occlusion, n=10), 3) re-perfusion group (60 minutes of superior mesenteric artery occlusion followed by 2 hours of reperfusion, n=10), 4) pyruvate group (injection of pyruvate after 30 minutes of ischemia, n=10) and 5) adult reperfusion group (60 minutes of superior mesenteric artery occlusion followed by 2 hours of reperfusion). Serum levels of SOD and ALT were measured at the end of the experiment. Histological studies of intestine, liver and lung were also carried out.ResultsThe plasma ALT level and mucosal injury score were significantly higher in the ischemia group than the control group (P＜0.01) whereas the SOD activities were significantly decreased compared to the control group (P＜0.01). The plasma ALT levels and mucosal injury scores in the pyruvate group were significantly lower in the pyruvate group compared to the reperfusion group (P＜0.01).ConclusionsIntestinal ischemia can damage the intestinal mucosa and liver function in immature rats. Reperfusion can lead to further injury. Pyruvate administered before reperfusion may attenuate but not completely block the liver and mucosa damage. The ischemia-reperfusion causes more damage to the intestine and liver in immature rats compared to the adult rats.
【Key words】Intestinal diseases; Reperfusion injury; Pyruvic aid
本研究采用幼鼠急性阻塞性肠缺血再灌注(I/R)模型，通过对肠I/R前后的小肠、肝、肺等器官的组织学改变、外周血中氧自由基产物和肝功能的检测，了解幼鼠肠I/R的病理及病理生理变化、组织器官损伤程度，观察丙酮酸对I/R损伤动物消化道局部和全身主要脏器的影响，为儿童肠I/R损伤的临床防治提供实验基础和理论依据。
材料和方法
一、动物模型制作
幼龄雄性Wistar大白鼠，2～4周，体重(95±12)g，共40只；雄性成熟Wistar大白鼠，8周，体重(278±13)g，共10只。动物禁食过夜，质量分数为0.2％的硫贲妥钠30ml/kg腹腔内注射麻醉后，取右侧卧位，固定于手术台上。左侧腹部、右腹股沟术野备皮、消毒，无菌操作分离右股动脉，插管，接三通管，连接一个含有0.3ml肝素生理盐水(肝素10μ/ml)注射器上(供抽血和给药用)。取腹膜后入路，分离肠系膜上动脉(SMA)，用无损伤血管夹夹闭其根部，缺血结束后松夹进行再灌注。实验结束时经股动脉取血及快速放血处死。
二、实验分组
幼龄动物(40只)被随机分成1～4组，每组10只。年龄8周的动物10只，为第5组。①手术对照组(shamoperationgroup,SG):动物进行上述操作，但不夹闭肠系膜上动脉。②缺血组(ischemiagroup,IG):动物进行上述操作，动脉夹夹闭肠系膜上动脉1h后股动脉快速放血处死。③再灌注组(reperfusiongroup,RG):动物进行上述操作，动脉夹夹闭肠系膜上动脉1h，去除动脉夹，再灌注2h后，股动脉快速放血处死。④丙酮酸组(pyruvate group, PyrG):操作同③， 在夹闭肠系膜上动脉30min时经股动脉给丙酮酸钠0.1g/kg。⑤成年大鼠再灌注组(mature group, MG):操作同③。
三、检测指标
1.超氧化物岐化酶(SOD)活性测定精确采血50μl，加入装有5ml生理盐水的离心管中，混匀，3000转/min离心10min，弃去上清，沉渣保存于深冻冰箱中(至少-20℃)。以邻苯三酚自氧化抑制法测定红细胞中SOD的活性。
2.肝功能检测测血清中谷丙转氨酶(ALT)含量，紫外分光光度计连续监测法，试剂盒由长征公司提供；仪器采用日立7170自动化分析仪（日本日立公司）。
3.组织形态学观察与肠粘膜评分在动物处死后，取距回盲部25cm处回肠组织5cm，小块肝脏和肺组织，质量分数为10％福尔马林的固定24h后、酒精梯度脱水、石腊包埋、切片，HE染色，光镜观察肺、肝脏及肠粘膜组织学改变［每个组织块连续切片3张，每张切片观察3个视野(80倍)］。肠粘膜损伤按Chiu氏六级评分评价［1］。
四、数据处理及误差控制
数据采用±s，t检验，显著性水平设为95％。
结果
一、血清ALT含量(IU/L)
血清中ALT检测结果表明：与手术对照组(52.13±11.18)相比，缺血组血清中ALT值(108.62±24.99)显著上升，两组间值差异有显著性意义(P＜0.05)，再灌注组ALT值(243.67±52.89)达缺血组的2倍(P＜0.01)，丙酮酸组的幼鼠血ALT值为144.50±38.8，与再灌注组相比差异有非常显著性意义(P＜0.01)，但仍明显高于手术对照组(P＜0.05)(图1)。
图1实验各组的红细胞SOD活性示意图
二、红细胞中SOD活性(NU/L)
红细胞SOD活性含量结果显示：缺血组SOD活性为3370.35±114.84，与手术对照组(3348.17±88.47)相比较无显著性差异(P＞0.05)；再灌注组中SOD活性(2806.24±202.12)与正常相比显著降低(P＜0.01)；丙酮酸治疗组的SOD酶活性为3320.99±201.40，与再灌注组相比均明显升高(P＜0.01)，与手术对照组SOD活性相比，丙酮酸治疗组无显著性差异(P＞0.05)(图2)。
SG：手术对照组，IG：缺血组，RG：再灌注组，PyrG:丙酮酸组
2实验各组的血清ALT水平示意图
三、组织学观察及肠粘膜评分
手术对照组的肠粘膜绒毛完整，无上皮下间隙扩张，病理学评分为0.33±0.50；缺血组可见肠粘膜的绒毛完整性部分被破坏，表现为绒毛上皮和固有层的中度分离、上皮下腔隙的扩大及部分绒毛顶端上皮层破损，极少数的绒毛顶端出血，病理学评分为3.08±0.28；再灌注组的肠粘膜改变最为严重，表现为大部分的绒毛被破坏，部分可以见到扩张的毛细血管，并可以发现部分固有层溃疡出血、固有层暴露，病理学评分为3.95±0.69；丙酮酸治疗组的肠粘膜改变以绒毛顶端的部分破坏为主，伴有部分的上皮层同固有层的中度分离以及部分的绒毛毁坏，病理学评分为3.06±0.66。
对肝脏的组织学观察在手术对照组、缺血组、治疗组和均未发现异常改变，但在再灌注组中可以见到肝细胞浆内的颗粒明显增加，细胞呈浊肿表现。
对肺组织病理学观察在手术对照组、缺血组、丙酮酸治疗组均未发现明显改变，再灌注组损害明显加重，表现为肺组织充血、肺泡间质水肿、炎性细胞渗出，部分肺泡壁破坏，肺泡不张。
与手术对照组相比较，缺血组肠粘膜损害显著性升高(P＜0.05)；再灌注组较缺血组粘膜损害更为显著(P＜0.01)；与再灌注组相比较，丙酮酸治疗可明显减轻缺血再灌注导致的肠粘膜损害(P＜0.01)(图3)。
