关键词： 先天性巨结肠症；基因表达；聚合酶链反应

【摘要】目的探讨RET基因的表达情况与先天性巨结肠发生的关系。方法采用RT-PCR技术对12例先天性巨结肠的狭窄段、移行段及扩张段分别做RET基因的表达，并以G3PDH作内参标，观察RET基因的表达情况。结果发现RET基因的表达从扩张段→移行段→狭窄段是逐渐减低的。结论提示RET基因与先天性巨结肠的发生有一定的关系。

Expression of RET Proto-Oncogene in Hirschsprung's Disease

ZHAN Jianghua, FANG Zhiqin, GU Jiqing.

Dept. of Surgery, Tianjin Children's Hospital, Tianjin 300074

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of RET proto-oncogene and the pathogenesis of Hirschsprung's disease.MethodsThe expression of RET proto-oncogene in the aganglionic, transitional and dilated segments of colon from 12 children with Hirschsprung's disease was studied by RT-PCR method. G3PDH was adopted as control.ResultsThe expression of RET proto-oncogene from the dilated segment to the transitional segment and aganglionic segment decreased gradually.ConclusionsExpression of RET proto-oncogene plays an important role in the pathogenesis of Hirschsprung's disease.

【Key words】Hirschsprung's diseaseGene expressionPolymerase chain reaction

先天性巨结肠症病因多为结肠远端或直肠内缺乏神经节细胞，原因不十分清楚。国外报道神经节细胞的移行过程与RET基因有着重要关系^［1，2］，本研究就引起神经节细胞移行过程中起至关重要作用的RET基因进行研究，现报告如下。

材料与方法

1. 组织准备：收集我院1997年7月～1998年1月12例HD患儿，其中新生儿4例，婴儿4例，3岁以上的4例；长段型1例，中段型2例，其余均为短段型。于手术中取每例患儿正常段及狭窄各200mg左右组织，置于液氮中，以便进一步做基因分析；另外将相同标本做组织学检查，并且证实取材准确无误。

2. RNA提取：总RNA提取按照RNA提取试剂盒(RNA gents total RNA isolation system, promege corporation, WI.USA)中介绍的步骤进行操作，提取RNA分别做电泳和光密度值测定，计算出浓度用于cDNA合成，RNA电泳观察18s和28s的比值，以确定RNA的质量；28s/18s接近于2/1，显示质量良好。

3. 逆转录过程(reverse transcription, RT)：取5μg总RNA进行cDNA的合成，逆转录采用第一链cDNA合成试剂盒(first steand cDNA synthesis kit, GIBCO BRL)中介绍的步骤操作，采用25μl反应体系，合成DNA用于PCR扩增。

4. PCR扩增所需引物：一对引物为473bp，用于扩增RET gene, 其序列为：上游：5′-TCAGCCGAGGACACCTCGG-3′；下游：5′-TCAGGGAAGCAGTTGCAGGTGC-3′。另一对引物为983bp的三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceral dehyde 3-phosphate dehydrogenase, G3PDH)，作为内参标，其序列为：上游：5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′；下游：5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。

G3PDH基因的RNA转录产物的表达在任何组织中被认为是不变的，故可将G3PDH作为内参标。

5. PCR扩增：PCR反应采用50μl反应体系，包括以下物质：5μlcDNA、20pmol上下游引物，200μmol4×dNTP、5μl10×PCR buffer, Taq酶和氯化镁(progema corp.), 然后加入2～3pmol G3PDH引物，用于检测反应体系的完整性。

PCR反应条件：预变性：94℃，3分钟；变性：94℃，1分钟；退火：66℃，1分钟；延伸：72℃，1分钟；后延伸：72℃，10分钟。共30个循环。

6. PCR产物电泳：PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，Markers为PBR322DNA/BstNI(天象人公司)。

结果

1. G3PDH在组织中的相似表达：

在每一份标本中，983 bp的G3PDH都具有相同的表达情况，证实了在每一份标本中最终合成的cDNA量是一致的。因此，可以断定这一反应体系是可靠的，并且可以用于分析RET基因的表达情况。在选取的不同年龄组中，其G3PDH的表达是一致的，并不随年龄的改变而改变。

2. RET基因在肠组织的不同部位中表达不同：

473 bp的RET基因在肠组织不同部位中表达具有明显的不同，并且我们还随机选取2例正常的肠管作对照，其结果显示正常肠管的RET基因和G3PDH的表达与扩张段的表达情况是完全一致的，所以可用每个患儿的扩张段作为其病变肠段表达的对照。在所有扩张段部位(即有神经节部位)RET基因扩增产物显示出明显的条带，在病变段(即无神经节部位)RET基因呈现出非常弱，甚至缺失的条带，而在移行段RET基因的扩增条带介于两者之间。在不同年龄组中，其RET基因的表达趋于一致，未出现明显差异性。

讨论

HD的病因概括起来有3种情况^［2，3］：① 胚胎发育期，形成神经元的神经脊胚细胞在向肠道远端移行过程中发生障碍；② 某些局部因素的变化，阻止脊胚细胞的聚集或杀死已聚集起来的细胞；③ 肠管本身微环境的变化阻止正常的胚胎发育过程。

假如我们把这3种情况都归因于某一基因的缺失或突变，该基因量的变化引起由头→尾移行过程的中断，或由于局部因素或微环境的变化引起该基因的错义、无义或移码突变，从而影响到神经节细胞发育过程中的障碍。就目前的研究看，这一基因很可能就是RET基因或包括RET基因的一组基因。

RET基因已被证明是引起HD的主要基因。在动物实验中，已经证实RET基因在神经节细胞中量的表达减少一半时，其神经节细胞就不能移行到肠壁内^［2］。RET基因剔除实验可以产生整个消化管的无神经细胞症^［4］。在鼠的胚胎发育过程中，肠道神经系统的RET基因表达可以在肠道肌层中和迷走神经元的肠神经母细胞中检测到；并且已证实有RET蛋白表达的神经脊胚细胞最终在特定的区域内形成有功能的神经元^［3，5］。由此可以推测RET基因的规律性表达对于日后形成肠神经元系统的神经脊胚细胞是最基本条件。

本实验发现，病变肠段的RET基因与同一患儿扩张段和移行段相比较明显减低；反复重复实验均有相似结果。RET基因表达量的减低可以提示在HD患儿中神经节细胞发育不良，我们在实验时，充分排除其他可能影响的因素，如每个患儿都选择狭窄段、移行段和扩张段(病理证实)相同大小的标本，采用相同的方法提取RNA，逆转录及PCR采用相同的反 应体系及相同的浓度，加入同样剂量引物及模板，PCR反应条件一致；其产物电泳结果、G3PDH的亮度是一样的。在这种条件下比较RET基因在不同肠段的表达情况，从扩张段、移行段到狭窄段，其基因的RNA表达是逐渐减低的。

本组12例标本比较结果显示，RET基因在不同年龄组中的表达情况基本上是一致的，即在扩张段及移行段中存在RET基因的表达，而在狭窄段中则缺乏表达，这种逐渐递减的表达正好与神经节细胞的数量相吻合，从而可以推断RET基因与神经节细胞的发育及移行有着密切的关系。

由于RET基因对于HD的发病原因起到相当大的作用，所以其量的表达减低可以诱发HD的发生。但并不排除其他基因也有同样的作用，如EDNRB基因和EDN3基因也与先天性巨结肠的发生有关，提示有进一步深入研究的必要。

参考文献

[1] Heyningen VV. One gene four syndrome. Nature. 1994, 367:319.

[2] Pachnis V，Mankoo BS, Costantini F. Expression of c-retproto-oncogene during mouse embryogenesis. Development, 1993, 119:1005.

[3] Watanabe Y, Ito T, Harada T，et al. Expression of ret proto-oncogene products in the hypoganglionic segment of the small intestine of congential aganglionosis rats. J Pediatr Surg. 1995, 30:641-645.

[4] Schuchardt A, D' Agati V, Larsson-Blomberg L, et al. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor RET. Nature. 1994, 367:380-383.

[5] Kusafuka T, Puri P. Altered ret gene mRNA expression in Hirschsprung's disease. J Pediatr Surg. 1997, 32:600-604.

(收稿：1998-07-06)