关键词： 先天性巨结肠症；酪氨酸激酶受体基因；聚合酶链反应-单链构象多态性

【摘要】目的从分子水平探讨先天性巨结肠(HD)的发病机理，了解中国人群HD发病与酪氨酸激酶受体基因(RET基因)突变的关系。方法30例HD患者(4例家族性和26例散发性)和30例对照者的外周静脉血经盐析法提取DNA后，应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法，对RET基因第15外显子(E15)进行基因突变的检测，对阳性片段进行直接测序。结果2例家族性患者的E15扩增片段在SSCP分析时发现有泳动变位。经DNA自动测序证实1例为错义突变Lys889→Thr，另1例在V906和S909密码子分别存在两个同义突变(GTGAAGAGGAGCCA→GTTAAGAGGAGTCA)。结论RET基因突变与中国人群家族性HD的发生有密切关系。

Mutation of RET Oncogene in Hirschsprung's Disease

XU Juan, WEI Mingfa, SHI Huifen, et al.

Department of Pediatric Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

【Abstract】ObjectiveThis study attempts to elucidate the relationship between RET oncogene and Chinese patients with Hirschsprung's disease.MethodsExon 15 of RET oncogene from 4 familial HD patients and 26 sporadic HD patients were analyzed with polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP).The positive amplifying products were then sequenced.ResultsTwo hete-rozygous mutations were discovered in 2 familial HD patients. Direct DNA sequence analysis identified a missense mutation Lys 889→Thr in one patient and two silent mutations at codon V906 and S909 in the other (GTGAAGAGGAGCCA→GTTAAGAGGAGTCA).ConclusionsThese new discoveries indicate that RET mutations may play an important role in familial HD in the Chinese population.

【Key words】Hirschsprung'sdiseaseRET genePCR-SSCP

先天性巨结肠(HD)是引起先天性肠梗阻的常见原因之一，其病因尚不够清楚。它在人群中的发病率约为1/4000～1/5000，其中有少于20%的患者来自多发HD的家系，显示该病具有遗传倾向^［1］。1993年后，国外学者利用DNA多态标记对部分HD家系进行连锁分析，将HD位点定位于10号染色体着丝粒附近，并通过进一步研究发现其可能致病基因为位于10q11.2上的RET基因^［2，3］，随后在一些HD患者中相继发现了RET基因的突变^［4～6］。国内在这方面的研究尚刚刚开始起步。为进一步探讨该病发生的分子机理，我们应用PCR-SSCP技术，针对RET基因第15外显子，对4例家族性和26例散发性HD患者的基因组DNA进行了检测。

资料和方法

1. 病例：30例HD患者均经钡剂灌肠、直肠肛管测压及直肠粘膜乙酰胆碱酯酶(AchE)组织化学检查等方法诊断为HD患者，术后病理检查均确诊。其中有4例来自3个HD小家系。患者父母均无便秘史。

2. 引物：引物序列依据文献［5］，由中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。其碱基序列为：15F：5′-GACTCGTGCTATTTTTCCTC-3′; 15R: 5′-TATCTTTCCTAGGCTTCCCA-3′。

3. 方法：① PCR扩增：每个患者取静脉血1.5～2.0ml，加EDTANa₂抗凝。盐析法提取DNA，同样方法提取30例正常人的DNA(正常人血样由北京协和医院采血室提供)。25μl反应体系含模板约100ng、50mmol/L KCl、10mmol/L Tris/HCl(pH8.4)、1.5mmol/L MgCl₂、引物各0.25μmol/L、dNTP各100μmol/L和Taq DNA聚合酶1U。反应体系经95℃ 5分钟变性后，以94℃ 30秒、56℃ 30秒、70℃ 1分钟循环30次，最后72℃延伸10分钟。所得产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。② SSCP分析：制备5%～10%(49∶1)的非变性聚丙烯酰胺凝胶(含甘油5%或10%)。5μl PCR产物与适量加样缓冲液(90%甲酰胺，溴酚蓝及二甲苯蓝各0.05%)混合，95℃变性5分钟后，冰浴骤冷，进行凝胶电泳：4℃、10℃或20℃，600V，7～10小时左右。电泳结束后用银染方法染色，进行观察。③ 测序：纯化的PCR产物经DNA自动测序仪进行测序。

结果

所有患者的DNA经PCR及琼脂糖凝胶电泳后均显示单一条带，长度与正常人一致。患者与正常人的E15扩增片段经SSCP分析，发现家族性患者B₂与C发生泳动变位。按电泳方向，B₂在正常人具有的两条单链DNA(b、c)前方又出现两条单链DNA带(d、e)，C在正常单链DNA带后方还有一条单链DNA带(a)。正常人中没有发现与他们相同的泳动变位。其余的HD患者没有发现泳动变位者。进一步经DNA自动测序仪分析，参考文献［7］，证实B₂在V906、S909密码子处分别存在GTGAAGAGGAGCCA→GTTAAGAGGAGTCA两个碱基置换，导致两个同义突变，C则有连续的两个碱基置换：AAG→ACC，导致Lys889→Thr错义突变。

讨论

从分子水平上对HD发病机理进行探讨，在国际上也是近5年内才开展起来的。据欧美国家对HD患者RET基因全部20个外显子突变的研究发展，家族性HD患者约40%～50%可发现RET基因的突变，散发性HD仅为15%～20%^［8］。国内此方面的研究才刚刚起步，尚不能形成统计资料，并且尚无对家族性HD患者进行基因突变研究的报道。我们在4例家族性HD患者中发现了1例有Lys889→Thr错义突变，另1例有Val906→Val和Ser909→Ser两个同义突变，表明中国人群家族性HD的发生与RET基因突变亦有密切关系。

RET基因长约80kb，含20个外显子，编码一种酪氨酸激酶受体。它在神经嵴源性细胞(如神经元和周围神经系统的神经节、神经内分泌细胞、表皮色素细胞等)中均有表达。而先天性巨结肠的胚胎学发生正是神经嵴内的神经母细胞在胚胎期第5～12周移行到消化管过程中的发育停顿。RET蛋白的功能和配体还不十分明确，我们推测它的功能受损可以影响到神经母细胞的正常发育。

E15编码具有酪氨酸激酶活性的关键区域。我们针对此外显子片段，对30例患者的基因组DNA进行了检测。PCR结果显示所有患者均扩增出与正常人扩增片段长度一致的单一DNA带，表明没有明显的插入和缺失突变。经SSCP分析显示2例家族性HD患者有泳动变位，由于均含有两条正常人所具有的单链DNA带，可以初步判断这两例为杂合型突变。据文献报道^［4～6］，HD患者的RET基因突变绝大多数为点突变，且均为杂合型，我们的发现符合这种情况。说明人类只需有一半的RET基因正常活性改变，就可以导致HD的发生。

经DNA自动测序进一步证实，C存在一错义突变，导致889密码子处赖氨酸被苏氨酸取代。赖氨酸是中性氨基酸，且带有一个羟基，而苏氨酸属于碱性氨基酸，故可以推测替换的氨基酸改变了原有的酪氨酸激酶活性中心，导致RET蛋白功能受损，影响了信号的正常传导，从而引发了HD。另一家族性患者B₂亦有泳动变位，但由于她的同胞B₁没有发现泳动变位，故可以初步判断此变异极可能属于一种多态，由亲代传递而来。两者的不同缘于从亲代承继了不同的染色体。由于此多态在人群中的基因型出现频率较低，而我们的样本数量有限，所以未能发现与B₂有相同变异者。经DNA自动测序证实B₂在V906、S909密码子处分别存在2个同义突变。我们推测导致B₁和B₂发病的基因突变可能在RET基因的其他区域或另外的基因上。

本课题为国家自然科学基金资助项目(NO.39670746)

参考文献

[1] Badner JA, Sieber WK, Garver KL, et al. A genetic study of Hirschsprung disease. Am J Hum Genet, 1990, 46:568-580.

[2] Lyonnet S, Bolino A, Pelet A, et al. A gene for Hirschsprung disease maps to the proximal long arm of chromosome 10. Nature Genet, 1993, 4:346-350.

[3] Yin L, Ceccherini l, Pasini B, et al. Close linkage with the RET proto-oncogene and boundaries of deletion mutations in autosomal dominant Hirschsprung disease. Hum Mol Genet, 1993, 11:1803-1808.

[4] Edery P, Lyonnet S, Muligan LM, et al. Mutations of the RET proto-oncogene in Hirschsprung disease. Nature, 1994, 367:378-380.

[5] Romeo G, Ronchetto P, Yin L, et al. Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in Hirschsprung disease. Nature, 1994, 367: 377-378.

[6] Attie T, Pelet A, Edery P, et al. Diversity of RET proto-oncogene mutations in familial and sporadic Hirschsprung disease. Hum Mol Genet, 1995, 4:1381-1386.

[7] Takahashi M, Buma Y, Lwamoto T, et al. Cloning and expression of the RET proto-oncogene encoding a tyrosine with two potential transmenbrane domains. Oncogene, 1988, 3:571-578.

[8] Chakravarti A. Endothelin re