关键词： 先天性巨结肠症；神经生长因子受体

【摘要】目的探讨神经生长因子受体(NGFR)在先天性巨结肠(HD)中的分布情况及其意义。方法应用NGFR免疫组化方法对10例3周～2岁的HD患儿及8例对照组患儿结肠进行染色观察。结果丰富的NGFR染色阳性神经纤维分布于正常结肠环肌层及粘膜下层，少量分布于纵肌层，NGFR染色阳性神经元分布于肌间神经丛及粘膜下神经丛；NGFR染色阳性神经纤维在HD无肌间神经节细胞肠段肌层及粘膜下层内明显减少或缺如，而肌间肥大的神经干及粘膜下神经干为NGFR染色阳性，并且在其外周可见一强阳性染色带。结论NGFR在无神经节细胞肠段的异常分布可能与HD的发病机理有关，NGFR免疫组化染色对HD可能具有诊断价值。

The Implication of Nerve Growth Factor Receptor Expression in Hirschsprung's Disease

LIU Hao, J.M. Vanderwinder, M.H. De Laet^*.

Department of Pediatric Surgery, First Affiliated Hospital, Xian Medical University, Xian 710061. ^*Departement de Chirurgie Pediatrique, Hospital Enfants Reine Fabiola, Belgium

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the distribution of nerve growth factor receptor (NGFR) in Hirschsprung's disease (HD) and its clinical implication.MethodsGanglionic and aganglionic colonic specimens from 10 children with HD and normal colonic specimens from 8 controls were immuno-stained with NGFR antibody.ResultsExtensive NGFR staining was found in the nerve fibers of muscularis and mucosae, neural tissue of the submucosal and myenteric plexuses of normal colon. NGFR positive nerve fibres were markedly reduced or absent in muscular layer and submucous layer while the hypertrophic nerve trunks in myenteric and submucosal plexuses showed a sheath of intense staining in the aganglionic colon from patients with HD.ConclusionsThe abnormal distribution of NGFR in the aganglionic bowel suggests involvement of NGFR in the pathogenesis of HD. NGFR immuno-staining may be a valuable diagnostic tool in HD.

【Key words】Hirschsprung's diseaseNerve growth factor receptor

先天性巨结肠(HD)是小儿胃肠道常见的先天畸形，Tiffin于50余年前即发现了在病变结肠远端缺乏神经节细胞，近些年来人们对HD进行了广泛研究，但其发病原因目前仍无定论。神经生长因子(NGF)对中枢和外周神经系统的发育和功能维持具有重要作用，NGF的生理效应是通过位于胆碱能神经元内的NGF受体(NGFR)来完成的^［1］。本文应用免疫组化方法观察NGFR在HD无神经节细胞肠段及正常对照组结肠的分布情况，以探讨NGF及NGFR与HD发病的关系。

材料与方法

一、 临床资料： 患儿组10例，年龄3周～2岁，男8例，女2例，7例为常见型HD，3例为长段型HD，均经手术及病理证实。取无神经节细胞的狭窄段结肠及神经节细胞正常肠段标本进行染色观察。对照组结肠取自5例尸检标本，死亡时间在6小时以内，不伴胃肠道疾病，年龄4月～17岁，另取3例高位肛门闭锁行结肠造瘘时之结肠标本作正常对照染色观察。新鲜标本立即固定于新配制的4%多聚甲醛溶液中，4℃ 24小时，组织块经过OCT包埋(Miles, Elkhart, IN), 再置于预放干冰中的2-甲基丁烷中速冻，保存在-80℃低温冰箱中，-20℃恒温冰冻切片机切片，将厚15μm切片裱贴于经0.1% Poly-L赖氨酸处理过的载玻片上。

二、 NGFR免疫组化染色： ABC酶标法，试剂为小鼠抗人NGFR单克隆抗体(mannheim boebringer, Belgium)，工作液浓度为1∶30，DAB显色。用正常血清或TBS代替一抗作对照，结果切片染色阴性。

结果

一、 正常结肠

NGFR在肠神经系统呈强阳性表达，正常结肠环肌层内含丰富的NGFR染色阳性神经纤维，纵肌层内含少量NGFR染色阳性神经纤维，肌间神经丛神经节细胞为NGFR染色阳性；粘膜下层也含丰富的NGFR染色阳性神经纤维，粘膜下神经元呈NGFR染色阳性；有时在结肠浆膜下可见NGFR染色阳性的神经纤维丛，但其形态与肌间神经丛及粘膜下神经丛明显不同，在其外周可见一强阳性染色带环绕(代表有髓鞘神经干)。

二、 先天性巨结肠

1. NGFR在神经节细胞正常结肠的分布与对照组结肠基本相同。

2. NGFR在无神经节细胞肠段的分布，环肌及纵肌层内NGFR染色阳性神经纤维明显减少或缺如，部分病例可见肌间隙有少量散在NGFR染色阳性小神经干，肌间粗大的神经干呈NGFR染色阳性，并且在这些染色阳性神经干外周也可见一强阳性染色带环绕，这一染色形态与正常结肠浆膜下之有髓鞘神经干的染色结果相近似；粘膜下层内NGFR染色阳性神经纤维也明显减少，粘膜下神经干呈NGFR染色阳性，有时亦可见在其外周有强阳性染色带环绕，有时亦可见到增生的小条索状神经干分布于粘膜下层。

讨论

HD以消化道远端无肌间神经节细胞肠段的持续性痉挛所致的功能性肠梗阻为特征。有些学者认为胚胎期神经节细胞发育停顿可能与HD发病有关，也可能为某种因素影响了外胚层神经节细胞向肠管的移行，并造成神经节细胞从前肠向后肠移行过程受阻，及肠神经元的发育障碍。病变结肠的持续痉挛可能与肠壁内非胆碱能、 非肾上腺素能抑制性神经(NANC)功能障碍有关，其中NANC神经的主要递质一氧化氮(NO)的缺失可能是HD发病的重要病理生理学基础^［2］。但至目前为止，影响神经节细胞移行以及肠神经元发育及成熟的因素仍不完全清楚。

NGF是最具有特征性质的一种神经营养因子(neurotrophic factor)，它由靶细胞所衍化(在消化道目前认为可能由肠管平滑肌细胞所产生，尚未被证实)，是前脑基底部胆碱能神经元的神经营养因子，并且是胚胎期和初生后交感神经和背根神经节细胞(dorsal root ganglion cells)的生存和成熟所必须的因子，NGF对肠神经系统的正常发育可能也起重要作用^［3］，Kuroda等研究发现NGF mRNA在无神经节细胞小鼠(piebald mice)患肠及HD患儿病变结肠均有异常表达^［4］。NGF的生理效应是通过位于胆碱能神经元内的受体来完成的，NGFR是一种跨膜型蛋白(transmembrane protein)，它能结合并引导NGF进入细胞而发生其生理效应^［5］。笔者通过免疫组化染色发现NGFR阳性神经纤维广泛分布于正常结肠肌层及粘膜下层，但在HD无肌间神经节细胞结肠段NGFR阳性神经纤维则明显减少或缺如，笔者曾观察1例14周及1例23周龄胎儿，发现NGFR染色阳性神经纤维已广泛分布于结肠壁内。由于NGFR在局部病变结肠内的缺乏，可能导致在HD已有异常表达的NGF的生理效应进一步发生障碍，可能影响胚胎期及出生后病变肠段肠神经系统的成熟过程，也可能会发生链索式的生物学效应而导致包括胆碱能神经、 肾上腺能神经以及NANC神经功能发生障碍，从而产生HD的临床症状。Kuroda等应用RT-PCT技术研究发现HD患儿结肠远端无神经节细胞肠段内NGF mRNA含量明显高于正常对照组，其解释为“代偿性”增生，并认为肠神经系统突触联系障碍可能干扰了神经节细胞的成熟过程或导致神经节细胞的损害，而NGF的功能异常可能是无神经节细胞症的致病因素^［4］。

HD病理改变特征之一是在无神经节细胞肠段内的外源性胆碱能神经纤维大量增殖，乙酰胆碱脂酶组织化学(AchE)检查可见粘膜下层及肌间之酶活性增强。而本实验观察发现位于胆碱能神经元内的NGFR阳性神经纤维在病变肠段内肌层及粘膜下层内明显减少。可能为HD病变结肠内胆碱能神经元先天发育异常和(或)在这些神经元内缺乏神经营养因子NGFR^［6］。关于HD无神经节细胞肠段肌间神经干的来源问题仍无定论。Tam等应用整封标本(whole-mount)研究提示肌间肥大的神经干为外源性增生而来^［7］，本实验结果与Kobayashi等的研究结果相符，即与正常结肠之内源性肌间神经丛不同，结肠浆膜下神经纤维丛的特殊染色表明其来源为外源性有髓鞘神经纤维，而这一特殊形态染色与HD无肌间神经节细胞肠段之肌间神经干染色结果相一致，因此提示其来源可能也是外源性^［8］。由于这些外源性神经纤维缺乏正常神经节细胞而不能与结肠壁内的内源性肠神经系统有效联系，肠的抑制性神经冲动不能有效传导，而可能最终导致病变结肠处于痉挛状态。

HD的诊断现仍是国内外学者探讨的课题，各种方法均存在不同程度的假阳性或假阴性结果，直肠粘膜吸引活检为一创伤小、 简便而实用的方法，但由于所取组织块较小，粘膜下神经元不典型等因素，故仍有一定程度的误诊率。笔者通过NGFR免疫组化染色观察发现，在HD无神经节细胞肠管之粘膜下层NGFR阳性神经纤维明显减少，但所有标本均显示粘膜下神经干增生，并可见到部分神经干外周有强阳性染色带环绕。目前尚未见到其他抗体免疫反应出现这种染色形态，因此，NGFR免疫组化染色也可作为诊断HD的手段之一。目前已有人应用负压吸取直肠粘膜NGFR染色诊断HD，其符合率达100%^［6］。

总之，NGFR的异常表达可能与HD发病的病理生<