原始神经外胚层肿瘤(Primitive Neuroectodermal Tumor, PNET)是儿童最常见的恶性神经系统肿瘤， 和大多数肿瘤一样， PNET的治疗以手术、 化疗、 放疗为主。随着分子生物技术的发展， 基因治疗给PNET患儿带来了希望， 本文就近年来PNET基因治疗进展作一简要介绍。

肿瘤基因治疗： 是指向肿瘤引入外源性基因， 以纠正或补偿其基因缺陷， 或通过增强宿主细胞对肿瘤杀伤能力和机体防御机制以达到肿瘤治疗目的的一类方法。具体说来， 就是要将目的基因转送到靶细胞， 并使之能稳定地表达^［1］。

基因转移的方式

一、 载体

1. 逆转录病毒载体： 逆转录病毒载体是最常用的转运系统。逆转录病毒是一种小的单链RNA病毒， 基因组包括3个结构基因。被整合入载体的外源单链RNA分子须满足2个条件： ①分子量小于10 kb。②含有一种称为psi区域的包装信号。将逆转录病毒的3个结构基因导入缺乏含psi区域RNA分子的细胞， 该细胞将合成不含RNA分子的空病毒载体， 这种转导细胞则称为包装细胞^［2］。目前已构建并筛选出多种产生病毒载体的包装细胞。常用的逆转录病毒载体是Maloney鼠白血病病毒(MoMLV)改建的病毒载体。逆转录病毒载体具有尤为适于脑肿瘤基因治疗的优点： 无需其他辅助病毒就可产生较高滴度； 仅转染分裂期细胞， 正常脑组织因只含少数分裂细胞而免受转染。

2. 腺病毒载体： 腺病毒具有比逆转录病毒更大更复杂的DNA基因组， 可以高效地转染各种类型细胞。不足之处在于高抗原活性， 多次体内使用可产生免疫反应； 能感染非分裂期细胞， 可能影响到正常脑组织^［3］。

3. 腺相关病毒(Adeno-associated virus AAV)载体： 腺相关病毒是一种小单链DNA病毒， 定点整合到宿主19号染色体。转染效率高。缺点是必须有腺病毒存在才能复制， 载体容量较小。

4. 单纯疱疹病毒载体： 作为中枢神经系统基因治疗的另一种载体， 单纯疱疹病毒具有大而复杂的双链DNA基因组。由于该病毒可能杀伤正常神经元并引起脑炎， 使用时必须减毒。在治疗恶性脑瘤方面， 由于突变型单疱病毒仅杀伤分裂细胞， 因而非基因治疗范畴 的治疗方式更引起人们的关注^［4］。

5. 非病毒载体： 脂质体介导的基因转移是近年来常用的方法， 脂质体是由脂质双层分子组成的闭合囊泡， 可包裹核酸和蛋白质。具有低毒、 低免疫原性等优点， 能有效转染非分裂相细胞。

二、 载体转移的方式

根据基因治疗策略及特性选定载体后， 需选择适当的方式将载体转移到靶细胞中。具体有下列几种方法：

1. 直接注射法： 直接向脑瘤组织注射逆转录病毒载体转运系统的包装细胞。这种产生含有外源基因载体的细胞移植物能在2周内在肿瘤局部有效合成病毒颗粒。但这一方法不适用于其他类型载体， 且产生的病毒滴度不高^［5］。

2. 增加血脑屏障通透性： 用特殊方法提高血脑屏障通透性， 利于大颗粒的病毒载体透过血脑屏障进入瘤组织， 体内实验已显示出高水平的转移率， 但由于载体在血浆中半衰期仅数秒， 转移率较低。

3. 大剂量冲击法(bulk flow)： 通过置入脑内的导管以每小时数百微升的速度向瘤组织冲入大量载体颗粒^［6］。

基因治疗策略

一、 自杀基因

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因， 是一种选择性杀灭肿瘤的“自杀”基因或称药物敏感基因。转导了HSV-tk基因的细胞对抗疱疹病毒药物(ganciclovir, GCV)敏感， 能被后者杀灭。最初Culver以逆转录病毒载体向恶性脑肿瘤组织转染HSV-tk基因并获成功^［5］。此后， 人们又以单疱病毒、 腺病毒等载体向多种类型脑瘤细胞转染HSV-tk基因治疗肿瘤^［7，8］。

实验证明， 由于存在“旁观者效应”， 位于HSV-tk阳性转染细胞周围未转染的细胞也能被GCV杀死。机理在于GCV毒性代谢产物通过细胞间缝隙连接传递， 此外肿瘤细胞坏死及免疫反应也可能起一定作用^［5，9］。

Tapscott^［10］将移植有9L瘤细胞的大鼠脑内导入仅含新毒素抗性基因的HSV-tk载体， 不经GCV治疗， 就引起了脑瘤的消退， 这一现象给HSV-tk/GCV系统的体内作用机制又提出了新的问题。

HSV-tk/GCV系统治疗脑瘤已进入Ⅰ～Ⅱ期临床实验， 关于疗效各家报道不一， 有待进一步研究。

二、 反义策略

不同类型肿瘤细胞恶性转化过程中， 伴随着大量分子遗传学的改变， 其中， 影响这些改变的基因； 参与或刺激瘤细胞恶性转化的基因； 与细胞增殖和血管发生有关的基因均可作为反义治疗的目标。反义治疗具体是指将目的基因以其相应的互补DNA(cDNA)封闭， 从而将其阻断在转录水平。

1. 针对胰岛素样生长因子(insulin like growth factor IGF)： IGF在细胞生长、 分化、 周期调节、 恶性转化等过程中起重要作用。IGF家族中IGFⅠ和IGFⅡ与脑瘤关系密切， Trojan^［11］将导入IGFⅡ反义核酸的C6胶质瘤细胞注入大鼠脑内， 11例肿瘤中6例较对照组明显缩小，另5例未见肿瘤形成， 将转入IGFⅡ反义核酸的瘤细胞和野生型瘤细胞分别注射入鼠脑两侧， 双侧均无肿瘤生长。IGFⅡ在决定瘤细胞的免疫表现型方面起重要作用， 针对IGFⅡ的反义策略可成为肿瘤治疗的一种方法。

2. 针对血管发生的反义治疗： 血管内皮生长因子(VEGF)作为一种有丝分裂原， 可促进包括肿瘤细胞在内的多种实体瘤的血管生成。研究表明， 转染并稳定表达有VEGF反义核酸的C6胶质瘤细胞移植到裸鼠皮下后， 其生长明显受抑制， 病理表现为瘤血管显著减少， 瘤细胞坏死率高^［12］。

3. 其他反应策略： 针对转化生长因子β(TGF-β)， 基础纤维细胞生长因子(bFGF)及原癌基因周期毒G1的反义策略均为脑瘤反义治疗研究的新方向。

三、 免疫治疗策略

利用免疫系统产生的高度特异的抗肿瘤毒性治疗脑瘤也是近年来研究的热点。

TGF-β是最早在胶质纤维瘤中分离的T细胞抑制因子。研究表明应用TGF-β反义核酸作用于9L鼠胶质瘤细胞， 可使荷瘤大鼠生存期明显延长。IGF-Ⅰ和EGFR对免疫应答的基因调控作用也在体内实验中证实， 提高局部IL-2或GM-CSF的浓度可有效增强该部位抗瘤免疫反应^［13］。

但脑肿瘤的免疫治疗效果比起其他肿瘤并不理想， 血脑屏障， 血-脑-肿瘤屏障阻碍了免疫反应可能是一个原因。

四、 其他基因治疗策略

向造血组织中转移耐药基因， 可有效地拮抗化疗药物对该类组织的剂量依赖性毒性。具体方法有： 应用逆转录病毒载体， 向造血祖细胞中转移mdrl基因， 二氢叶酸还原酶基因或6-烷基鸟嘌呤烷基转移基因。这些方法已逐渐用于临床辅助化疗。

应用VEGF受体的突变体与野生型受体结合， 可阻断VEGF的功能， 抑制肿瘤血管生成。

原始神经外胚层肿瘤的基因治疗

脑肿瘤的基因治疗方法大多适用于原始神经外胚层肿瘤， 由于PNET具有高度恶性增殖， 容易沿脑脊液通路播散以及高复发率的特点， 因而PNET的基因治疗也有其独特性。存在遗传分子缺陷的神经祖细胞在神经系统成熟过程中往往发生恶性转化， 不能分化成熟为正常的中枢神经系统神经元， 这种恶性转化细胞成为PNET瘤细胞的来源^［14］。

一、 HSV-tk/GCV系统

应用HSV-tk/GCV系统治疗进展期或复发性儿童幕上恶性肿瘤是常用方法。结合立体定向技术在局部脑瘤组织注射高浓度的包装细胞， 从而有效地抑制肿瘤生长， 对于肿瘤脑脊膜播散的PNET患儿， 这种治疗系统尤为适用， Oldfield已将此法成功地用于动物模型实验中， 由于逆转录病毒载体在脑脊液中具有一定稳定性， 又容易进入蛛网膜下腔， 因而可沿脑室系统对自由漂浮的岛状瘤细胞发挥充分的杀伤作用^［15］。

二、 补偿抑癌基因

针对p53等抑癌基因的基因治疗是近年来研究的重点。野生型p53基因在维持细胞正常生长， 抑制恶性增殖过程中起重要作用。约50%的人类肿瘤伴有p53基因的突变，Rosenfeld首次报道利用携带野生型p53基因的缺陷单纯疱疹病毒载体， 转染p53突变的成神经管纤维瘤细胞系。转染细胞内p53蛋白功能被激活， 表现为mdm2蛋白水平增高和细胞周期受阻。

三、 基因修饰的免疫治疗

过继免疫治疗， 通过鞘内注射体外培养经IL-2基因修饰的自体LAK细胞， 可使PNFT患儿生存期显著延长。机理在于LAK细胞经IL-2基因修饰后活性增强， 在肿瘤局部发挥较大程度的杀伤作用。提高肿瘤局部的淋巴因子浓度， 可直接杀伤瘤细胞， 或加强其他免疫细胞的抗肿瘤作用， 研究人员在PNET动物模型体内注射TNF， 4周后， 注射组较对照组肿瘤明显缩小^［17］。

基因修饰肿瘤细胞的“肿瘤疫苗”疗法。PNET患儿<