关键词： 先天性巨结肠；免疫组织化学；神经生长因子受体；P^75NGFR

摘要目的： 研究神经生长因子受体(P^75NGFR)在先天性巨结肠(HD)中的分布及其与HD发生的关系。方法： 应用免疫组化技术对30例HD患儿进行检测， 观察各段肠管中P^75NGFR的分布情况。结果： 正常肠段的粘膜固有层和粘膜肌层中有大量的P^75NGFR阳性纤维， 粘膜下和肌间神经丛中神经节细胞表现为P^75NGFR强阳性， 痉挛段肠管粘膜固有层和粘膜肌层中P^75NGFR阳性纤维明显减少或缺如， 粘膜下和肌间粗大神经纤维的神经束膜表现为P^75NGFR强阳性， 象一个环包绕在周围。结论： P^75NGFR在HD痉挛段中的异常分布可能与HD的发生有关， P^75NGFR染色可作为诊断HD的方法之一。

Immunohistochemical Study of P^75NGFR in Hirschsprung's DiseaseWang Fu, Mu Xuesong, Wang Huizhong. Dept. of Pediatric Surgery, The Second Clinical College. China Medical University. Shenyang 110003

AbstractObjective: To investigate the distribution of Nerve Growth Factor Receptor (P^75NGFR) in Hirschsprung's disease (HD) and the relationship between P^75NGFR and HD. Methods: Different segments of bowel from 30 children with HD were immuno-stained with monoclonal antibody of P^75NGFR and the distribution of the staining was observed. Results: Large number of immunoreactive fibres was detected in lamina propria and muscularis mucosae. Strong staining of ganglion cells in the Auerbach's and the Meissner's plexus were observed on the normal specimens. There was very little or no immunoreactive fibre in the lamina propria and muscularis mucosae of the aganglionic bowel. However there was strong immunoreactivity in the perineurium of the hypertrophic nerve trunks in the submucosal and intramural layers of aganglionic segments. Conclusions: The abnormal distribution of P^75NGFR may be related to Hirschsprung's disease. P^75NGFR staining may be an additional modality to the diagnosis of HD.

Key wordsHirschsprung's diseaseImmunohistochemicalNerve growth factor receptorP^75NGFR

先天性巨结肠(hirschsprung's disease, HD)病因的经典解释是胚胎发育过程中神经母细胞在肠壁内移行障碍， 但导致神经母细胞移行障碍的原因仍不十分清楚。近年发现神经营养因子家族通过与位于细胞膜上的受体结合而影响神经细胞的存活、 发育、 分化和成熟。P^75NGFR是神经营养因子受体之一， 它可和神经营养因子家族中每一成员结合。本研究观察HD各肠段中P^75NGFR的分布情况， 探讨其与HD发生的关系及HD的病因。

材料与方法

在我院行手术治疗并经病理证实的HD患儿30例。男26例， 女4例， 年龄3个月到10岁。2例为长段型， 28例为普通型。取痉挛段(无神经节细胞肠段)、 移行段和正常段(手术切除近端有神经节细胞肠段)标本， 分别作石蜡切片的HE染色和冰冻切片的免疫组化染色。免疫组化染色用S-P法， AEC显色， 显微镜下观察肠壁各层中染色情况， 呈现红色者为阳性； 无红色者为阴性。

P^75NGFR单克隆抗体由德国宝灵曼公司生产； S-P试剂盒由福州迈新生物技术有限公司提供。

结果

一、 正常段(有神经节细胞肠段)：

HE染色见粘膜下和肌间神经丛中有较多神经节细胞。

免疫组化染色见粘膜的固有层和粘膜肌层中有大量P^75NGFR阳性细胞和纤维， 粘膜下和肌间神经丛中可见到较多的P^75NGFR阳性纤维， 神经节细胞表现为P^75NGFR强阳性。5例在环肌层中可见到P^75NGFR阳性细胞。

二、 痉挛段(无神经节细胞肠段)：

HE染色在粘膜下和肌间神经丛均未见到神经节细胞。

免疫组化染色见粘膜的固有层和粘膜肌层中P^75NGFR阳性纤维明显减少或缺如， 粘膜下和肌间粗大的神经纤维表现为P^75NGFR阴性， 但神经束膜表现为P^75NGFR强阳性， 象一个红色环包绕在异常神经束周围。

讨论

神经生长因子(nerve growth factor, NGF)为最早发现的神经营养因子家族成员， 是中枢胆碱能神经元和来源于神经嵴的感觉神经元存活所必需的因子， 也是胚胎期和生后早期交感神经元和背根神经节细胞存活和成熟所必需的。NGF能促进神经元的轴突生长和数目增多， 但它需要与位于细胞膜上的受体结合而发挥作用。神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)分为高亲和力受体和低亲和力受体。高亲和力受体为trkA， 它是与细胞信号传递有关的原癌基因TRK编码的蛋白产物之一； 低亲和力受体是一种分子量为75 kd的蛋白质， 故称P⁷⁵蛋白， 即P^75NGFR。

P^75NGFR是一种跨膜糖蛋白， 分为细胞外区、 跨膜区和细胞内区， 细胞外区富含半胱氨酸， 为配体结合区； 跨膜区是受体最保守的区域； 细胞内区因没有ATP结合位点， 故不能引起生物应答， 只参与调节作用， 但它是NGF和trkA结合所必需的。P^75NGFR参与构成NGF高亲和力结合位点， 并增加trkA对NGF的亲和力， 也能增强trk蛋白家族对神经营养因子的特异性^［1］。

目前已知P^75NGFR位于中枢胆碱能神经元的细胞膜上， 在前脑基底核分布最多， 但在外周神经系统的分布仍不十分清楚。本研究结果显示P^75NGFR在肠内神经系统中也有表达。近年实验^［2］发现肠上皮细胞可以合成和分泌NGF， 且分泌方式具有极性， 仅选择性分泌于基底侧， 这有助于NGF弥散到固有层中发挥作用。我们观察到正常肠段的粘膜固有层和粘膜肌层中有大量P^75NGFR阳性细胞和纤维， 与上述研究结果一致， 说明NGF及P^75NGFR对肠内神经系统的正常发育起一定作用。正常肠管中神经节细胞表现为P^75NGFR强阳性， 说明神经节细胞表达P^75NGFR， 神经节细胞的正常发育很可能受P^75NGFR及神经营养因子的影响， 同时提示神经丛周围的某些细胞可以合成和分泌NGF。

除神经细胞外， 许多非神经细胞也可表达P^75NGFR， 如肾上腺嗜铬细胞、 雪旺氏细胞等。我们在少数病例正常段环肌层中见到P^75NGFR阳性表达， 提示正常肠道平滑肌也表达P^75NGFR， 多数病例未见到P^75NGFR表达可能是平滑肌中合成P^75NGFR较少， 低于免疫组化技术所能检测到的最低值。已报道虹膜平滑肌细胞可以合成NGF^［3］， 故推测肠道平滑肌细胞也合成NGF。

Kuroda等^［4］发现HD患儿无神经节细胞肠段粘膜层中NGF阳性纤维缺如， 本研究发现HD患儿痉挛段粘膜层中P^75NGFR阳性纤维也减少或缺如， 说明HD痉挛段中有NGF及P^75NGFR发育缺陷， 提示P^75NGFR异常可能与HD的发生有关。应用免疫交感神经破坏法研究证明， 肠内的交感神经有NGF依赖性， 但HD患儿粘膜层中NGF阳性纤维缺如， 而粘膜层中有大量增生的乙酰胆碱酯酶阳性的神经纤维， 进一步证实HD粘膜层中增生的纤维是副交感神经源性而不是交感神经源性。

近年研究^［5］发现P^75NGFR与细胞凋亡(apoptosis)， 或称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)有关。P^75NGFR的结构与其他生长因子受体或激素受体分子没有相似性， 却与肿瘤坏死因子受体(TNFR Ⅰ、Ⅱ)、 人类细胞表面抗原Fas(Apo-Ⅰ)、 B细胞抗原CD₄₀有同源顺序， 这些因子均调控细胞死亡。Rabizadeh等^［5］发现在细胞培养过程中使细胞表达P^75NGFR， 则细胞死亡数明显增多， 说明P^75NGFR促进细胞死亡； 但加入其单克隆抗体或NGF后， 促细胞死亡作用被抑制， 且与NGF结合时促进细胞生长作用增强。HD患儿粗大的神经纤维束膜表现为P^75NGFR强阳性， 说明痉挛段神经纤维束膜上有大量P^75NGFR表达， 因而我们推测HD神经节细胞发育异常是局部P^75NGFR表达过多、 NGF相对不足所致。

细胞凋亡在神经系统发育过程中起重要作用。Takaharu等^［6］发现预后好的神经母细胞瘤中细胞凋亡的发生率明显增高， 并认为细胞凋亡与神经母细胞瘤的自行退化有关。因而需进一步研究HD发生是否有细胞凋亡机制参与。

过去认为直肠粘膜抽吸活检标本的AchE组化检查是诊断HD简单而可靠的方法， 但有时会出现假阳性和假阴性结果。P^75NGFR免疫组化染色改变主要在粘膜和粘膜下层， 染色结果易于观察， 其特异性和敏感性与AchE相同^［7］， 且免疫组化染色操作简单， 结果精确， 因而P^75NGFR染色可