毕允力 综述 高解春 审校

基因治疗是指应用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法^［1］。经历了动物细胞体外遗传修饰、 动物直接基因转移、病毒载体的应用, 尤其是重组DNA技术的诞生,使基因治疗成为了肿瘤、遗传病及病毒性感染等临床治疗的全新方法。至今, 已有百余个人基因标记或治疗的临床方案进入人体实验阶段^［1］。基因治疗在小儿肿瘤的研究尽管起步较晚、报道不多, 但因小儿肿瘤的先天性、胚胎性和相关基因关系密切而已显示出其肿瘤基因治疗的前景令人鼓舞。本文综述介绍转基因的主要方法、肿瘤基因治疗的主要策略和小儿肿瘤基因治疗的研究现状,以期有助于此研究在国内的开展。

一、 转基因的主要分子生物学技术

基因治疗的关键是将基因转移入相应的靶细胞中,而这种基因转移可以是整合在染色体中,或是成为稳定的附加体存在于被修饰的细胞中,并且还要在靶细胞中长时期有效表达。 这种成功、 稳定、高效表达的转基因技术是基因治疗的前提,目前常用方法有下列几种。

1. 直接注射法: 将含有环状DNA的溶液直接注射入需要进行转基因的组织。 wolff等^［2］证实在肌肉组织中,信号基因有高水平的表达, DNA的存在时间可长达60天,但RNA和蛋白质的半衰期仅24小时。 这一方法简单、 经济、无毒、 可转移较大的DNA构建, 但表达产物的水平太低, 时间过短。

2. 磷酸钙共沉淀法: 将氯化钙、培养细胞、DNA和磷酸盐缓冲液在一起缓慢混合时,即有磷酸钙微细沉淀形成, 并能附着在细胞膜上,经过细胞吞饮作用而进入细胞浆中, 并完成基因转导。 但转化频率通常很低,需要有一很强的选择基因。

3. 脂质体转染法:带有单价或多价阴离子的脂类能和带多价阳离子的DNA或RNA进入细胞,且不必通过溶媒体。这一方法简单、重复性好、无毒性、无免疫原性,且不受DNA片段大小影响。 其对增殖细胞的转染率比静息细胞高。

4. 受体介导的基因转移: DNA与具有细胞特异性的载体分子结合,该分子再与特定细胞受体结合, 形成吞饮小泡使DNA进入细胞。目前研究最多的是去唾液血清粘蛋白-多聚赖氨酸(asialoorosmucoid-polylysine),其中多聚赖氨酸通过静电作用与DNA结合,去唾液粘蛋白与肝脏异的受体去唾液酸糖蛋白结合,通过静脉注射即可实现对肝脏的基因转移。这一方法碰到的棘手问题是进入细胞的吞饮小泡与lysosome结合,使绝大部分DNA降解。 使转染基因的表达很短暂而应用前景受限。

5. 电穿孔法和微粒子轰击法:前者是利用脉冲电场, 后者是以高能微粒子轰击将DNA导入培养细胞或活体组织,并可通过单一选择基因的选择而得到多拷贝的转化细胞,往往可以达到高水平的暂时性表达, 但均需特殊设备,费用较贵。

6. 逆转录病毒载体法:是应用最广、最有效的转基因方法。逆转录病毒载体的构建是用限制性内切酶全部或部分切除病毒基因序列中的反式作用区域,使其失去致病能力, 然后在这种缺陷病毒的基因中插入目的基因,通过包装细胞产生类病毒颗粒, 具有感染性,但无复制能力。 Rosenberg等^［3］已证实其安全性。但理论上它仍有可能通过一次以上的重组产生致病的病毒颗粒,其引起转染细胞恶变的可能性并不能完全除外。

7. DNA病毒载体法:一般应用腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒作载体,常能整合到宿主DNA的特异部位中,尤其对重组基因的转导常可产生稳定的整合。但由于缺乏反式激活功能的辅助细胞系和对形成有毒的、特异性的野生型基因的担忧, 使其应用阻力甚大。

二、 肿瘤基因治疗的主要策略

1. 修正肿瘤相关基因: 癌基因的激活、抑癌基因的失活或丢失是肿瘤发生的分子生物学基础。 应用基因治疗手段,修正肿瘤相关基因的功能可使肿瘤细胞恶性表型发生逆转,向正常细胞转化。 其主要手段有原位修复缺陷的基因、缺陷基因的替代疗法; 重新开放已关闭或失活的基因, 阻断或抑制癌基因的激活或表达等。应该说, 这些基因治疗策略是最理想的途径和目的。

针对癌基因激活的肿瘤发生机制,学者们应用人工合成的反意寡核苷酸,与特定癌基因RNA正链结合成双链,抑制癌基因的激活或过度表达。 Holt和Cooney等^［4］用合成的15个和27个核苷酸作用于C-myc cRNA, 结果特异性抑制C-myc基因的转录而抑制肿瘤细胞的增殖。

鉴于某些抑癌基因的失活或丢失可导致肿瘤发生,将抑癌基因导入肿瘤细胞是使肿瘤细胞恶性表型向正常细胞转化的有效手段。但由于肿瘤的发生是一个多阶段、 多步骤、多基因的复杂过程,单一基因恢复对肿瘤发生的逆转作用仍属探索试验阶段。

2. 免疫基因治疗:是将特定的免疫基因通过载体转染或导入宿主的靶细胞而提高细胞免疫力, 达到治疗肿瘤的目的。

常用的有细胞因子基因治疗,通过细胞因子基因转染淋巴细胞、转染肿瘤细胞或转染皮肤成纤维细胞或角质细胞, 增强局部细胞因子浓度,从而达到直接或间接杀伤肿瘤细胞同时减少细胞因子副作用的目的。 例如向TIL细胞内导入TNF、 iL-2、 IL-4、 γ-干扰素等。 另外黏附分子基因转染导入肿瘤细胞和MHC分子基因导入肿瘤细胞也是近年免疫基因治疗的热点。

实验证实, 导入B/7及(或)MHC基因的肿瘤细胞可使宿主产生系统性、全身性的抗肿瘤免疫应答, 使肿瘤在体内的再生长受到抑制。

3. 病毒导向的酶解药物前体疗法:其作用机制是将目的基因通过逆病毒转染靶细胞后在靶细胞表达产生特定的酶,该酶可催化药物前体产生细胞毒性药物而破坏肿瘤细胞。

此法最常见的是利用单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷酸激酶(TK)将某些药物(核苷类拟似物,如ACV、 GCV、 PCV等)磷酸化, 其产物可阻断肿瘤细胞DNA合成而使肿瘤细胞死亡。当转染细胞存在着该肿瘤的组织特异性启动子时也可通过酶基因转录而选择性地介导肿瘤细胞或同一组织来源细胞的破坏而达到消灭肿瘤的目的。

三、 小儿肿瘤基因治疗的研究近况

小儿肿瘤,尤其是恶性肿瘤相关基因的深入研究,为基因治疗创造了良好基础。

1. 肾母细胞瘤基因治疗研究:鉴于抑癌基因与肾母细胞瘤发生关系的日益明确,尤其是位于11 p13~15的WT₁基因的杂和性缺失(LOH)导致肾母细胞瘤发生的机制已深刻认识。 dowdy等^［5］于1991年通过微细胞融合法将含有11 p15.5~11 p14.1的染色体转入WT₁基因缺失的肾母细胞瘤G401细胞株中,同时对照转导到人纤维母细胞瘤株中,再进行裸鼠接种观察致瘤性, 结果证实转导11 p15.5~11 p14.1染色体的肾母细胞瘤致瘤性消失,而纤维母细胞瘤致瘤性不变。 证实WT₁抑癌基因转录对肾母细胞瘤致瘤性有明显逆转作用。

针对肾母细胞瘤IGF2的异常高表达的存在和其表达与肾母细胞瘤生物特性改变的关系,Drummond等^［6］1992年应用硫酸钙共沉淀法将WT₁和CAT基因转导到IGF2高表达的肾母细胞瘤细胞中,结果发现WT₁和CAT活性高的转导细胞IGF2表达明显低下,提示WT₁基因的转录可使肾母细胞瘤IGF2表达受抑制,对肾母细胞瘤的生物特性有影响作用。

近年,针对存在WT₁ DNA序列无异常的肾母细胞瘤存在mRNA表达异常,Haber等^［7］选择其为标志基因,以野生型WT₁通过脂质体转染法导入存在异常拼接WT₁基因的RM细胞株,组织培养显示集落形成减少,裸鼠接种也提示致瘤性降低,进一步为WT₁基因的失活机制及其基因治疗开拓新的途径和思路。

2. 神经母细胞瘤的基因治疗研究: 由于MYCN(N-myc)Q基因异常扩增是神经母细胞瘤的一个基本特征, Rosolen等^［8］对MYCN基因高表达的细胞株转导MYCN反意DNA寡核苷酸,结果发现转导后的肿瘤细胞增殖活性降低,并出现了细胞分化。 而Gross等^［9］将MYCN基因同NEO基因通过脂质体转染法导入神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,测定转染细胞内两种基因拷贝数, 检测结果mRNA量与转入基因拷贝数成正比,为MYCN基因研究找出了一个新的实验模型。

近年关于神经母细胞瘤自然转归和细胞凋亡的研究更使基因治疗有了新的方向。针对未化疗的神经母细胞瘤1/3有blc-2基因表达和化疗后80%有blc-2表达,Dole等^［10］对无blc-2表达的Shep-1神经母细胞株导入blc-2基因,然后对转导组和未转导组均以顺铂和VP-16药物处理,研究发现转导组抑制了药物诱导的肿瘤凋亡,与临床凋亡耐药研究结果一致。

藤田等将γ-干扰素转入A/J鼠神经母细胞瘤c1300株中,证实免疫基因治疗可抑制鼠皮下肿瘤形成, 此改变可被抗CD-3抗体和抗干扰素抗体所抑制,而且MHC-1类抗原表达明显增强,对肿瘤相关抗原的表达起修饰作用,对肿瘤的杀伤作用明显^［11］。

3. 其他小儿肿瘤的基因研究:视网膜母细胞瘤的发生与其抑癌基因RB失活和丢失关系密切。 Trent等^［12］将正常RB基因转入视网膜母细胞瘤后明显减少了肿瘤细胞的增殖,而将TNF、 γ-IFN等细胞因子转基因进行纤维母细胞瘤、横纹肌肉瘤细胞株的动物体外实验均提示有改变致瘤性或抑制肿瘤生长的作用。近年受成人肝癌基因治疗的影响, 已有将AFP基因表达调控片段的RAV-TK基因重组经逆转