关键词： 肾母细胞瘤；基因；甲基化作用

摘要 目的: 观察小儿肾母细胞瘤p16基因启动子区有无甲基化及有甲基化者与组织类型和预后之间关系。 方法: 20例肾母细胞瘤(5例肾组织作对照)进行甲基化观察,使用三种内切酶分别为Fnu D Ⅱ、 Sac Ⅱ、 Hpa Ⅱ。 结果: 肿瘤组有6例出现甲基化(对照组无甲基化),除1例属于预后良好型(FH)之外, 余5例均属预后不良型(UH)。甲基化与组织类型有关。 随访结果有甲基化病例(UH组), 1例术后1.5年死亡, 1例术后半年复发,证明甲基化影响着预后。 结论:肾母细胞瘤p16基因启动子区存在甲基化,甲基化者属于组织预后不良类型者多。

Observation on Methylation of p16 Gene in Promoter Region in children with Nephroblastoma Wang Changlin, Gao Hong, Wang Xiangang, et al. Dept. of Pediat. Surg. The 2nd Clinical College, China Medical university,Shenyang 110003

Abstract Objective: To study the existence of methylation of p16 gene in promoter region in children with nephroblastoma and the relation between methylation and histologic type of the tumor as well as the prognosis. Methods: Twenty cases with nephroblastoma were observed on by3 kinds of enzyme (Fnu D Ⅱ, Sac Ⅱ, Hpa Ⅱ), and 5 normal kidneys served as control. Methylation was found in 6 patients (FH 1, UH 5), but none in controlgroup. In UFH group, one died 1.5yrs after operation, with recurrence i

n another 1.5yrs postoperatively. Conclusions: Methylation exists in the promoter region of p16 gene, and its positiveness indicates the tumor with UFH type and poor prognosis.

Key words Nephroblastoma Gene Methylation

本研究目的旨在了解小儿肾母细胞瘤p16基因启动子区有无甲基化,并观察有甲基化者与肿瘤的组织类型、 分期、 预后之间的关系,以探讨该项检查的临床意义。

材料与方法

1. 材料来源: 收集我院1991~1996年手术治疗的20例小儿肾母细胞瘤为研究对象。术中切取瘤组织1 cm×2 cm, 置入-70 ℃超低温冰箱中一并检查。 20例中,男16例, 女4例。 年龄从6个月至8岁。 按NWTS-3标准, Ⅰ期2例, Ⅱ期11例,Ⅲ期5例, Ⅳ期1例, Ⅴ期1例。 组织类型: 预后好组织类型(FH)7例, 预后差组织类型(UF)13例,全部病例获访。对照组5例,取材于同期手术切除的重肾组织。

2. DNA提取步骤: ① 将冷冻组织作切片, 每片厚10μm, 取出15~20片, 置入Eppendorf离心管中。 ② 加入TE液1 ml, 10% SDS 20 ml, 蛋白酶K(20 g/L)10 μl, 在37 ℃水浴中振荡12小时。 ③ 抽提: 加入等体积酚, 混匀, 13 000 r/min离心10分钟, 吸上清, 弃沉淀; 加入等体积酚和氯仿混匀, 13 000 r/min离心10分钟,吸上清, 弃沉淀; 等体积氯仿和异戊醇混匀,13 000 r/min离心10分钟, 吸上清, 弃沉淀; 加入2倍体积的冷无水乙醇,1/10 3 mol/L NaAc混匀, 在-70 ℃下持续30分钟, 13 000 r/min离心15分钟,弃上清, 沉淀空干, 加入1/10体积的TE液, 溶解DNA。

3. PCR扩增: 依次加入DD.H₂O(重水), 10×buffer, dNTP,引物为(p16/外显子1及p16/外显子2), 多聚酶(试剂均购于上海复华股份有限公司), dNA 1 pg/L, 混匀, 按以下条件循环: 先94 ℃ 3分钟变性, 再94 ℃ 1分钟, 55 ℃ 30秒、72 ℃ 40秒、 行21个循环, 最后72 ℃ 1分钟延伸。

4. 丙烯酰胺凝胶电泳: EB染色(10 mg/L),紫外透射仪观察结果。

5. 甲基化检测: 应用甲基敏感的限制性内切酶Fnu d Ⅱ、 Sac Ⅱ、 Hpa Ⅱ进行DNA消化,三种内切酶均取10单位, 10×buffer DNA各量, 37 ℃ 2小时。采用酚-氯仿抽提法, 重新扩增,循环条件同前, 电泳观察结果。 如果样品第1次酶切没出现甲基化,再做第2次, 方法同前。

结 果

对照组p16基因启动子区没有甲基化, 肿瘤组6例检出甲基化,分别为Ⅱ期4例, Ⅲ期2例。出现甲基化的病例与组织类型的关系,预后好组织类型有1例(Sac Ⅱ、 Fnu D Ⅱ出现甲基化),现生存3年; 预后不良组有5例, 明显多于FH组。随访结果: 1例术后1.5年死亡, 三种内切酶检查结果均为阳性; 1例(Fnu D Ⅱ阳性)术后半年复发,再次手术, 生存已2.5年; 余者现生存不足2年, 其中三种内切酶检查均为阳性1例, Sac Ⅱ、 hpa Ⅱ阳性1例, Fnu D Ⅱ阳性1例。

讨 论

多肿瘤抑制基因(MTS1)是1994年4月发现的一种新型抑癌基因^［1,2］。现已明确MTS1位于人类第9号染色体短臂(9 p²¹)上, 由3个外显子(126 bp、 307 bp、 11 bp)和两个内含子组成, 外显子序列编码的蛋白质产物分子量近16000, 简称p16。 p16为细胞周期依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白, 其范围限定在40 kb之内^［1］。据统计, 约有75%的癌细胞株有p16的基因缺失与突变, 人们预测其重要性不亚于RB与p53两个基因,甚至比它们更为重要^［3］。Kamb等检测肺、 乳腺、 膀胱、 肾、 脑等290种不同肿瘤的细胞株,约75%的细胞中有p16基因缺失与突变, 超过了p53基因突变率; Drlow等通过Sowthern印迹法及染色法发现原发性膀胱癌在第9号染色体上等位基因的突变率为77%^［4］。可见p16基因改变之大。

现已查明在肾母细胞瘤中存在的癌基因有N-myc、IGF2、C-erbB-2,抑癌基因有WT₁、WT₂、RB、p53等,这些基因改变对肿瘤发生、发展起到不同作用。肾母细胞瘤p16基因启动子区出现甲基化, 致使p16基因不能转录,从而影响该基因表达, 不能抑制肿瘤进展^［5］。本组20例肾母细胞瘤组织检查结果, p16基因启动子区甲基化出现率为6/20(30%)。分析这些病例, 5例属于预后差的组织类型, 1例属于预后好的组织类型,显示预后差的组织类型明显多于预后好的组织类型。有甲基化的病例,术后复发者多。甲基化与分期之间的关系尚需进一步探讨。

参考文献

1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436-440.

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3 Marx J. A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor. science, 1994, 264:1846-1864.

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(收稿: 1997-05-12)