【摘要】目的分析中国人语前非综合征性耳聋 (NSHI) 患者 GJB2基因编码区的突变。方法采取来自浙江地区43个独立家系的43例语前NSHI患者（包括隐性遗传和散发性）血样，用3对引物经聚合酶链反应（PCR）扩增GJB2基因，产物依次部分重叠覆盖全部编码区1～681 bp片段；用单链构象多态性(SSCP)分析法进行突变筛选,部分异常带型的PCR产物经T克隆、DNA测序以明确突变方式；对有GJB2基因突变的部分患者，做家系分析明确患者纯/杂合子情况。 结果43例语前NSHI患者中,PCR-SSCP呈明显异常带型者有11例；测序发现3种突变方式和2种多态性改变，最常见的突变方式为235delC。结论中国人语前NSHI患者存在相当比例的GJB2基因的突变，且有数种不同的突变方式；中国人语前NSHI患者最常见的突变方式为235delC。

Mutations in the GJB2 gene in Chinese patients with prelingual non-syndromic hearing impairment

ZHENG WenboLUO JianhongLI Yun

（Laboratory of Medical Molecular Biology, Zhejiang University Medical School，Hangzhou 310031，China）

【Abstract】ObjectiveGJB2 gene is the first gene identified to be responsible for recessive non-syndromic hearing impairment (NSHI). The mutations of this gene were found in 50% of the recessive NSHI cases and in 10%～37% of the sporadic in Caucasoid population. To date, there has been no any report on GJB2 gene mutations in Chinese cases with NSHI. The purpose of this study was to examine mutations in the coding region of GJB2 gene in Chinese patients who have prelingual NSHI, including both recessively inherited and sporadic cases. MethodsThe authors enrolled 25 cases with recessive and 18 cases with sporadic prelingual NSHI. All the 43 cases (25 males and 18 females) came from unrelated families from the cities of Hangzhou and Ningbo, Zhejiang province, with the age ranged from 9 to 20 years. Samples from 15 persons who have normal hearing were taken and used as control. GJB2 gene sequences of genomic DNAs from the 43 cases were amplified by PCR with three pairs of primers respectively. The products overlapped partially in turn and covered the whole coding region of the gene. They were subjected to single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Some of positive samples were T cloned and sequenced to determine their mutation patterns. According to the results of SSCP and DNA sequence, SSCP has been done as well for the samples from family members of some cases in order to further ascertain their mutated GJB2 gene being either homozygous or heterozygous. ResultsTwenty-six percent (11/43) of the cases examined were found to have apparently abnormal shift of bands on SSCP gels. There were three different patterns of mutation and 2 polymorphisms found in all mutations. The mutation 235delC was the dominant pattern of GJB2 gene mutations in Chinese prelingual NSHI patients，which was present in 19% (16/86 chromosomes). ConclusionsAmong Chinese prelingual NSHI patients GJB2 gene mutations may exist in considerable proportion with several different patterns of mutations. The most common mutation of GJB2 gene in the studied Chinese cases with prelingual NSHI was 235delC.

【Key words】Deafness;genes;Mutation;Polymorphism, single-stranded conformational

语前聋是指出生时或3岁前就出现听力丧失，群体发病率为1/1 000，其中至少一半的患者是由遗传缺陷引起的。70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）。NSHI可以呈常染色体显性、常染色体隐性、X连锁及线粒体遗传，其中以常染色体隐性遗传最为常见，占75%～80%，且症状严重^［1］ 。目前已定位的NSHI候选基因为49个，10个已被克隆，其中编码连接蛋白26(CX26)的GJB2基因位于人染色体13q11-12上，编码区为681 bp^［2］ 。研究发现：50% 的白种人常染色体隐性遗传性NSHI与GJB2基因突变有关，即使是散发病例该基因突变也达10%～37%。 目前常染色体隐性遗传性NSHI中，GJB2基因的突变方式有42种，以30delG/ 35delG为多，占70%^［3，4］。至今尚无有关中国人遗传性耳聋患者GJB2基因突变的研究报告。本研究旨在分析中国人语前NSHI患者GJB2基因编码区的突变。

对象和方法

一、 对象

所选的43例患者分别来自43个独立家系，来自浙江省杭州、宁波及附近县市，年龄9～20岁， 其中儿童23例（年龄＜15岁），成人20 例。男性25 例，女性18 例。语前NSHI的病例特点是语前有中、重度感音神经性耳聋，以此为单一症状，多为隐性遗传。挑选的患者均为3岁前发现耳聋，听力检测证实为一级耳聋，排除药物致聋等原因，无智力低下等其他症状，父母听力均正常。 其中隐性遗传性NSHI 25例,标准为患者同代人（仅指兄弟姐妹，包括患者）中至少有两人为耳聋患者（22例）或父母为近亲结婚（3例）；散发性NSHI18例，标准为只有患者一人患耳聋。病例由浙江省杭州市聋哑学校和宁波市鄞县特殊教育学校提供，病史通过家系调查获得，临床测听结果由校医务室提供。

正常对照15人，来自浙江省各县市，入选标准为听力正常，无其他重大疾病，其中男性9 例，女性6 例，年龄19～50岁。

二、方法

1．基因组DNA的抽提： 采取外周血,盐提取法提取基因组DNA^［5］。

2. 聚合酶链式反应(PCR)： GJB2基因编码区用3对引物进行PCR扩增。引物由德国人类遗传研究所合成并提供。引物a序列为：上游 5′-TCTTTT-CCAGAGCAAACCGC- 3′,下游 5′-GACACGAAGATCA-GCTGCAG-3′。上游引物位于mRNA 5′非编码区,距离翻译起始密码子有31 bp,因而突变检测范围相当于起始密码子上游31bp至5′端78个密码子，正确的PCR片段大小应为285 bp。引物b序列为：上游 5′-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG-3′,下游 5′-AGCCGTCGTACATGACATAG-3′,扩增范围为172～481 bp, 正确的PCR片段大小应为310 bp。引物c序列为：上游 5′-CTTCTTCCGGGTCATCTTCG-3′，下游 5′-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3′， 扩增范围为420～746 bp，正确的PCR片段大小应为327 bp。反应条件为 94℃变性2 min, 经94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min循环35个周期。用低熔点大范围琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。

3．PCR产物的单链构象多态(SSCP)-银染分析： 取3 μl PCR产物，加入加样缓冲液10 μl和7 μl H₂O，混匀。100℃变性5 min后立即置于冰浴中5 min。电泳条件为：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶大小为80 cm×100 cm×0.75 mm, 缓冲液为0.5×TBE，室温下170V电泳约3 h。将凝胶经常规银染法显示条带，并干燥、拍照。

4．PCR产物的T克隆及测序： 用EcoRV酶切、T4连接酶加T 处理pBluescript SK(+)载体，通过T克隆将部分病例SSCP结果为异常带型的PCR产物亚克隆进pBluescript SK(+)载体，其中一例的PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出两条带，两条带分别切胶纯化、亚克隆进载体。扩增后用自动DNA测序仪(PE310)测序。

5．GJB2基因突变的患者纯/杂合子判定： 根据SSCP和DNA测序结果，对2例有GJB2基因突变的患者，分别采父母血样，行PCR-SSCP-银染分析，明确患者纯/杂合子情况。

结果

一、PCR产物的凝胶电泳情况

所有样本经引物b、c扩增均获得大小正确的单一条带，分别为310 bp、330 bp。绝大多数样本经引物a扩增获得片段大小正确的单一条带（约285 bp），但有2例存在较大片段的缺失，一个为纯合子（例10），另一个为杂合子（例11）（图1）。

二、SSCP-银染结果

15例正常人对照的引物a 扩增产物有3种方式的带型 （图2A）， 与泳道1、2、3带型式样相同的分别有10人、3人、2人。43例患者中，与泳道1、2、3带型式样相同的分别有21例、3例、9例。患者中引物a的PCR产物呈异常带型者有10例，至少有4种不同的异常条带式样,其中7例有相同的式样(图2)。 引物b的PCR产物有2种异常条带式样：明显异常者仅1例；有7例式样一致，但改变不明显，这7例与图2中提到的带型式样一致的7例为相同患者（图3）。引物c的PCR产物未发现明显异常者。

泳道1～8为引物a扩增产物，9和10分别为引物b和c扩增产物。泳道1和2为正常人对照，泳道3～10为患者。2例存在大片段缺失：泳道6 （例10）为纯合子，泳道7（例11）为杂合子

图1部分样本GJB2基因PCR扩增片段凝胶电泳结果

(A) 泳道1～3为正常人对照；泳道4～11为患者，分别记为