【摘要】目的探讨血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）基因多态性在不同激素效应和病理改变的原发性肾病综合征（NS）患儿中的分布及意义。方法用聚合酶链反应（PCR）分别检测107例健康儿童和42例NS患儿的ACE基因，并同时用紫外法分别测定血清ACE的活性。结果（1）NS患儿激素部分效应及无效应组的DD型基因频率为60 %，与激素完全效应组（5 %）比较差异有显著意义（P＜0.01）。（2）肾活检15例中局灶节段性硬化（FSGS）的病理改变者6例，其中ID基因型1例，DD基因型5例，无II基因型；non-FSGS病理改变者9例，其中II基因5例，ID基因3例，DD基因1例。两组各基因型分布比较显示：FSGS组以DD型为主（与non-FSGS 组比较P=0.0 019），non-FSGS 组以II型为主（与FSGS 组比较P=0.0 419）。（3）正常儿童ACE的活性为（25±17）U/L，NS患儿血清ACE的活性为（28±18） U/L，两组比较差异无显著意义（t=1.07,P＞0.05）；但每组不同基因型之间血清ACE活性差异均有显著意义（正常组F=29.01,NS组F=65.56;P均＜0.01）。（4）激素完全效应者的血清ACE活性为（13±3）U/L，激素无效应及部分效应者血清ACE活性为（18±4）U/L，两组比较差异有显著性意义（t=3.09，P＜0.01）。（5）FSGS患儿血清的ACE活性为（38±10）U/L，non-FSGS患儿血清的ACE活性为（23±12）U/L，两组比较差异有显著意义（t=2.18，P＜0.05）。结论（1）ACE-DD型与小儿NS的肾小球硬化和激素部分效应或无效应的发生有关。（2）DD型者的血清ACE活性最高，II型的最低。（3）激素无效应及部分效应者的产生和FSGS的发生均与血清ACE的活性增高有关。

Angiotensin Ⅰ-converting enzyme gene polymorphism in children with nephrotic syndrome

DANG Xiqiang, YI Zhuwen, HE Xiaojie, et al.

Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between angiotensin I converting enzyme (ACE) gene polymorphism and nephrotic syndrome (NS) in children. MethodsThe ACE genotype of 42 children with NS and 107 healthy controls was detected by using polymerase chain reaction (PCR). Serum ACE activity was measured by ultraviolet-assay at the same time. Results(1) The distribution of ACE DD genotype was significantly different between the groups poorly and well responded to corticosteroid therapy (60 % vs. 5 %, P＜0.01). (2) Of 15 cases in whom renal biopsy was performed, 6 had pathological changes of focal segmental glomerular sclerosis (FSGS), of whom 1 case had genotype ID, 5 had genotype DD, i.e., none of the 6 cases had genotype II; of the 9 cases without FSGS pathological changes, 5 had genotype II, 3 had genotype ID and 1 had genotype DD. Comparison of genotype distribution between the 2 groups showed that genotype DD dominated the FSGS group (P=0.0019 compared with the non-FSGS group), while genotype II dominated the non-FSGS group (P=0.0419 compared with FSGS group). (3) The serum ACE activity showed no difference between the patient group and control group (28±18 U/L vs. 25±17 U/L, P＞0.05). But the activity was significantly different among different genotypes within each of the 2 groups (F=29.01 for the control group and F=65.56 for NS group, P＜0.01 for both groups). (4) The serum ACE activity showed significant difference between the groups poorly and well responded to corticosteroid therapy (18±4 U/L vs. 13±3 U/L; t=3.09, P＜0.01). (5) The serum ACE activity was significantly different between children with FSGS and children without FSGS (38±10 U/L vs. 23±12 U/L; t=2.18, P＜0.05). Conclusions(1) Genotype DD is associated with poor responsiveness to corticosteroid therapy and FSGS in NS children. (2) The NS patients with genotype DD had the highest serum ACE activity and those with genotype II had the lowest. (3) The higher serum ACE activity was associated with poor responsiveness to corticosteroid therapy and FSGS in NS children.

【Key words】Peptidyl-dipetidase A;Polymorphism (genetics);Nephrotic syndrome;Child

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）在小儿肾脏疾病中的发病率仅次于急性肾炎，是小儿常见的肾脏疾病之一。我国小儿肾脏病科研协作组的调查结果显示NS占同期住院泌尿系疾病患儿的21 %^［1］。糖皮质激素是治疗小儿原发性NS的首选药，其疗效与NS的预后相关，而NS的肾小球硬化既是激素抵抗的因素之一，又是NS进行性发展为终末期肾衰的病理基础。应该注意到肾小球硬化的发生，不同个体之间存在着明显的差异，这使人们联想到个体基因背景可能起着重要作用。有关血管紧张素Ⅰ转换酶（angiotensin Ⅰ-converting enzyme, ACE）基因多态性的研究，为人们寻找这方面的答案提供了新的途径。ACE基因存在着插入/缺失（insertion/deletion，I/D）多态性，与循环和细胞内ACE水平有关，负责47 %的血清ACE水平变异^［2-4］ 。有报道ACE基因DD型是局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）激素疗效差和发展为慢性肾衰的危险因素^［5］。我们旨在探讨不同激素效应和不同病理改变的原发性肾病综合征（NS）患儿ACE基因多态性的分布特点及其意义。

对象和方法

一、 研究对象

病例来源于1997年6月至1998年12月我院住院的原发性NS患儿，共42例，其中男29例，女13例，1～3岁6例，～6岁14例，～14岁22例。平均年龄（7±3 ）岁。激素完全效应者22例，部分效应和无效应者20例。作肾活检的15/42例中激素完全效应者6例，部分效应和无效应者9例;FSGS 6例(均为激素部分效应和无效应者),非FSGS（non-FSGS） 9例（包括微小病变型3例，系膜增殖性肾小球肾炎6例；激素完全效应者6例，激素部分效应和无效应者3例）。对照来源于健康普查的儿童共107例，其中男78例，女29例，0～3岁9例，～6岁32例，～14岁66例。平均年龄（6.8±2.0）岁。

二、诊断标准及实验方法

1. 诊断标准：原发性NS的诊断系依据1981年全国小儿肾脏病协作组拟订的标准^［6］，其病理诊断依据1986年中华肾脏病学会肾脏病理协作组拟订的标准^［7］。

2. DNA抽提及聚合酶链反应 (polymerase chain reaction ，PCR)扩增：采1～2 ml新鲜全血（柠檬酸钠抗凝），用苯酚和氯仿法抽提外周血白细胞DNA。根据Hubert等^［8］发表的ACE 基因顺序，选择第16内含子PHA4.3区域两侧序列合成引物。引物由上海生物工程研究所合成。引物序列为：

正引物:5′CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT 3′

负引物:5′GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T 3′

PCR反应体系：50 μl反应液中含DNA 0.1 μg，引物各10 pmol/L，MgCl₂ 2.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，10×Buffer 5.0 μl，Taq DNA 聚合酶1U。PCR扩增条件：首先96 ℃变性1 min后进入循环： 96 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后一个循环延伸72 ℃10 min，在PCR仪上完成扩增。

3. 结果判定：取PCR产物10 μl，经1.2 %的琼脂糖凝胶电泳后，溴乙锭中染色，紫外透射灯下观察结果，PCR扩增产物判断^［2］：只有一条190 bp片段的为缺失型（DD型），只有一条490 bp片段的为插入型（II型），既有190 bp片段，又有490 bp片段的为ID型。

4. 血清ACE活性测定：晨8：00点采血1 ml（均无近期使用ACE抑制剂史）。操作步骤按试剂盒（购自海军总医院）说明书进行。采用紫外分光光度计测定血清ACE活性。

二、 统计学处理

所有数据均输入计算机，用SPSS 8.0统计软件包进行分析。首先计算各比较组ACE基因I/D多态性的基因型频率，检验各基因型是否达到遗传平衡，即确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡公式 P²+2Pq+q²=1^［9］，经计算后证明已达遗传平衡，说明具有群体代表性。所有计量资料均采用均数±标准差表示，组间比较ACE的活性用秩和检验（Kruskal-Wallis法）或t检验。分类资料用频数表示，组间比较采用χ²检验,对理论频数小于1或例数小于40者，用四格表的确切概率法计算P值。P＜0.05视为有统计学意义。

结果

一、肾病综合征和正常儿童ACE基因分布比较

两组各基因型间分布差异无显著意义（表1）。

二、不同激素效应的42例肾病综合征患儿ACE基因分布比较

两组各基因型分布比较，II型、DD型的差异有显著意义、ID型差异无显著意义（表2）。

三、15例不同病理类型的肾病综合征ACE基因分布

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