免疫球蛋白重链可变区(immunoglobulin heavy chain variable region，IgH)是抗原特异性结合部位，在体液免疫中起关键作用^［1，2］。编码人类IgH的胚系基因含有约200个可变区(V_H)、20个多样化(D)和6个连接区(J_H)基因片断^［1］。IgH基因序列多样化是产生成千上万高特异性和高亲和力抗体的基础，它通过V_H-D-J_H连接的多样性和不精确性、N区(非基因编码的碱基序列)插入及V_H基因片断上的体高突变等方式达到^［1］。迄今为止，未见有人类不同胎龄新生儿IgH基因谱的系统分析和比较，故在本研究中，我们分析了极不成熟儿（25～30周）、不成熟儿（31～36周）和成熟儿（37～41周）IgH基因中的V_H和J_H基因片断的随机使用、体突变率、N区的插入和N区-D基因片段-N区（NDN）长度、开放性阅读框(open reading frame，ORF)等情况，以探讨新生儿成熟度对IgH基因多样性的影响。

对象和方法

已排除宫内细菌和病毒感染，胎龄分别为25～30周（10例）、31～36周（12例）和37～41周（11例）的新生儿，于出生时留取0.2ml肝素抗凝脐血，用微量血DNA抽提试剂盒（QIAamp^TM，德国Qiagen公司）抽提DNA。应用PTC-100型DNA扩增仪（美国MJ research INS公司）对模板DNA进行2次扩增IgH基因序列（套式PCR，Nested PCR），扩增所用的第1套、第2套引物的碱基顺序分别为:5′CAGGTACAGCTGCA-GCAGTCAG 3′和5′TGAGGAGACGGTGACC 3′、5′TGGATCCG-CCAGGCTCTCNGG 3′和5′GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG 3′。 第1次扩增次数和条件为：在5个循环的变性94℃ 3 min、退火56℃ 3 min和延伸72℃ 2 min后，紧接着的是35个循环的变性94℃ 20 s、退火45℃ 30 s和延伸72℃ 2 min；第2次扩增次数和条件为：5个循环的变性94℃ 3 min、退火62℃ 3 min和延伸72℃ 2 min，然后是35个循环的变性94℃ 20 s、退火45℃ 30 s和延伸72℃ 1 min。用5%聚乙酰胺凝胶分离扩增物，第1次和第2次PCR产物均为多克隆性（在凝胶上呈云雾状条带形分布），其长度分别280～300和240～260 bp（图1）。应用LigATor plus Ligase试剂盒（德国R&D Systems 公司），将第2次扩增物与载体连结并转移到大肠杆菌内生长后，进行克隆筛选（每个新生儿挑选6个克隆）。根据Sanger的双脱氧末端终止法，使用ABI377型DNA序列自动分析仪（美国Perkin elmer公司）进行IgH基因序列测定。用电子计算机对所得到的序列与基因库中的IgH胚系基因序列及相互之间进行比较和分析，内容包括V_H和J_H基因片断的使用N区长度、体突变，以及开放性阅读框等。

统计学处理：采用统计软件SPSS for Windows 9.0处理，t检验、χ²检验或方差分析测试它们的差异显著性。

M：标志；N1：极不成熟儿；N2：不成熟儿；N3：成熟儿；W：水(阴性对照)；D：Daudi DNA(阳性单克隆对照)；T：扁桃体DNA(阳性多克隆对照)

图1IgH基因第2次扩增产物电泳图(5%

聚乙酰胺凝胶，溴乙锭染色)

结果

极不成熟儿的60个克隆、不成熟儿的72个克隆和成熟儿的66个克隆被用于IgH基因序列分析，结果发现：

1.V_H基因片段的使用率：极不成熟儿和不成熟儿优先使用V_H1(40.0%和38.3%)和V_H3(29.2%和33.3%)；成熟儿主要使用V_H3、V_H5 和V_H1(30.3%、21.2%和19.7%)；随着胎龄增加，V_H1和V_H3的使用率逐渐下降(P＜0.01)，其余V_H的使用率有所增加(P＜0.05)。

2.J_H基因片段使用率:在极不成熟儿和不成熟儿，优先使用J_H3(46.7%和40.3%)和J_H6(35.0%和41.7%)，J_H4的使用率(8.3%和6.9%)和J_H5的使用率(均为8.3%)较低，J_H2偶被使用（2.7%)，J_H1未被使用；在成熟儿，J_H3的使用率相对较高(31.8%)，J_H6、J_H5和J_H4的使用率相似(22.7%、21.2%和21.2%)，J_H2的使用率仍不高(3.0%)，J_H1仍未被使用；随着胎龄增加，J_H3和J_H6的使用率下降（P＜0.01），J_H4和J_H5的使用率上升(P＜0.01)，J_H2的使用率变化不大（P＞0.05）。

3.D基因片段的使用、N区的插入及NDN长度：在极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿，均优先使用D2基因片段，使用率分别为45.0%、45.8%和48.6%，三者差异无显著性（P＞0.05）。在IgH基因序列的V_H-D-J_H连接点处，极不成熟儿无N区插入，不成熟儿9.7%的序列有N区（1～5个碱基）插入，成熟儿21.2%的序列有数量不等的N区（1～9个碱基）插入；NDN长度分别为(13.5±7.2)、(16.8±6.5)和(22.3±7.2) bp，差异有非常显著性（P＜0.01）。

4.H基因片段上的体突变:在极不成熟儿，13.3%的 IgH基因序列存在点突变（仅在1个位点）；在不成熟儿，16.7%序列存在点突变（9个为1个位点的点突变，3个为2个位点的点突变）；在成熟儿，30.3%序列存在点突变（12个为1个位点的点突变，8个为2个位点或以上的点突变）。上述的点突变分别属于A→G、C→G、T→C、G→T或C→T的置换突变。

5.ORF：在极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿，分别65.0%、68.1%和92.4%的IgH基因序列有ORF，成熟儿与极不成熟儿或不成熟儿差异有非常显著性（P＜0.01），而不成熟儿与极不成熟儿之间，差异无显著性（P＞0.05）。尽管如此，ORF仍是随新生儿胎龄的增加而增加（P＜0.05）。

讨论

动物实验表明，针对特异性抗原起反应的免疫系统的发育是一个受控的渐进过程，对此过程具有重要影响的事件就是IgH胚系基因的重排。它是在B淋巴细胞发育和成熟过程中，IgH胚系基因实现V_H-D-J_H连接后形成。IgH基因重排多样化使得抗体谱多样性增加^［1，2］。本研究发现，胎龄25周以上的人类早产儿（包括极不成熟儿和不成熟儿）即有重排的IgH基因存在，加上他们能产生抗体的事实^［3］，说明人类新生儿的早期生长发育阶段，使V_H-D-J_H实现连接的机制已处于活化状态。这种处于活化状态的重排IgH基因是完整、具有功能的基因，能够转录mRNA并翻译免疫球蛋白（抗体）^［1］。至于为何早产儿产生的抗体不但量少而且亲和力低，也可以用本研究的结果来解释：由于在极不成熟儿和不成熟儿的重排IgH基因中，V_H、J_H基因片断的随机使用率和内在性体突变率低、NDN长度短及ORF少等原因，基因多样性极其有限，故其编码的抗体谱多样性和亲和力较低。

动物实验结果提示：胎鼠和新生鼠的IgH重排基因的V_H-D-J_H连接点处的N区缺乏或虽有插入但极短；胎猪IgH基因重排中，某些VH基因片断被偏倚使用^［4，5］。Cuisinier等^［6］发现胎儿优先使用接近D基因片段的V_H基因片段如V_H5和V_H6，Stollar^［7］则发现成人V_H、D和J_H基因片段的使用是随机的，有较长的N区和高体突变存在。本研究首次发现，不同胎龄组新生儿IgH基因存在异型性：在早产儿，偏倚使用V_H1和V_H3，而在成熟儿（足月儿），则主要使用V_H3 、V_H5和 V_H1。胎龄越小，NDN长度越短、体突变率越低，以及开放性阅读框越少。至于J_H基因片段使用，在所有的新生儿，J_H3的使用率均最高，J_H2偶被使用，J_H1未被使用；随着胎龄增加，J_H3和J_H6的使用率下降，J_H4和J_H5的使用率上升。在体突变的克隆中，大多数为置换突变A→G、C→G、T→C、G→T或C→T。综合Cuisinier、Choi和本研究的发现，可以推测：新生儿成熟度对IgH基因的重排产生明显影响，即随着新生儿的不断成熟，V_H、D和J_H基因片断的随机使用率，内在性体突变率、N区的长度，以及开放性阅读框等也增加，进而IgH基因多样性逐渐增加，表明人类新生儿和(或)胎儿体液免疫系统的发育也是一个渐进的发展过程。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800175）；广东省自然科学基金资助项目(980713）

参考文献

1，Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 1983, 302 :575-581.

2，Bhat NM, Bieber MM, Teng NN. Heavy chain variable gene usage by human B-1 lymphocytes and polyreactive autoantibodies. Hum Antibo, 1997, 8:146-150.

3，Ballow M, Cates KL, Rowe JC, et al. Development of the immune system in very low birth weight (less than 1 500g) premature infants: concentrations of plasma immunoglobulins and patterns of infections. Pediatr Res, 1986, 20:889-904.

4，Feeney AJ. Lack of N regions in fetal and neonatal mouse Ig V-D-J