【摘要】目的研究化疗药物诱导白血病细胞凋亡的作用及其与Bcl-2表达、临床预后指标及临床疗效的关系。方法利用形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、凋亡指示抗体APO 2.7结合流式细胞仪检测法，研究临床治疗相关剂量的化疗药物诱导急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞、急性混合性白血病(HAL)细胞的凋亡及其Bcl-2表达率。结果(1)用临床治疗相关剂量的长春新碱(VCR)、地塞米松(Dex)、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)作用20～24 h后，多数患儿（分别为22/24、19/24、6/11、6/6）的白血病细胞可发生凋亡。但是DNR引起部分患儿（3/11）的白血病细胞发生坏死。(2)VCR组与Dex组以及Ara-C组与Dex组的诱导凋亡率呈高度正相关，相关系数分别为0.821(P＜0.001)和0.994(P＜0.001）。(3)新鲜离体白血病细胞的凋亡率为(3.2±1.9)%。ALL及HAL细胞体外培养24 h后的自发凋亡为(18.2±13.5)%，且与VCR，Dex及Ara-C的诱导凋亡率呈正相关，相关系数分别为0.878（P＜0.001）、0.893（P＜0.001）、0.882（P＜0.05）。(4)CD₃₄是影响白血病细胞凋亡率的独立指标。阳性组（CD₃₄≥30%）的VCR、Dex诱导凋亡率及自发凋亡率明显低于阴性组。(5)白血病细胞的Bcl-2表达率与药物诱导凋亡率及自发凋亡率无负相关关系。结论诱导凋亡是临床治疗相关剂量的化疗药物杀伤白血病细胞的重要机制。

Apoptosis of leukemic cells induced by chemotherapeutic drugs in vitro

CHENG Jinrong, ZHAO Xinmin, ZHENG Huyong

（Beijing Children′s Hospital Affiliated to Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045, China）

【Abstract】ObjectiveTo study the ability of the chemotherapeutic drugs for inducing apoptosis and its relation to the Bcl-2 expression of leukemic cells, the prognostic factors and the efficacy of clinical treatment. MethodsThe morphologic study, agarose gel electrophoresis and flow cytometry were utilized to investigate the apoptosis of acute lymphoid leukemia (ALL) and hemoblastocy acute leukmia (HAL) cells induced by vincristine (VCR), dexamethasone (Dex), cytosine arabinoside (Ara-C) and daunorubicin (DNR) at clinically relevant dosage. The flow cytometry was also used to study the expression of Bcl-2 on leukemic cells.Results(1) Exposure of leukemic cells to clinically relevant concentrations of VCR, Dex, Ara-C and DNR for 20～24 hours resulted in apoptosis in most patients (22/24, 19/24, 6/11 and 6/6, respectively). Necrosis was found in leukemic cells of some patients (3/11) on DNR treatment. (2)The proportion of apoptotic cells induced by some chemotherapeutic drugs showed positive correlations with each other. The correlation coefficient of apoptotic rate in VCR group and Dex group was 0.821 (P＜0.001), in Ara-C group and Dex group was 0.994 (P＜0.001). (3)The apoptotic rate of fresh leukemic cells was (3.2±1.9)%. ALL and HAL cells cultured for 24 hours in vitro would develop spontaneous apoptosis in (18.2±13.5)%. The spontaneous apoptosis rate correlated positively to the apoptosis rates induced by VCR, Dex and Ara-c, the relevant coefficients were 0.878 (P＜0.001), 0.893 (P＜0.001) and 0.882 (P＜0.05), respectively. (4)CD₃₄ was an independent factor influencing apoptotic rates, the apoptotic rate was significantly lower in CD₃₄ positive group (CD₃₄≥30%) than that in CD₃₄ negative group. (5)There was no relationship between the expression of Bcl-2 and the apoptic rate of leukemic cells. ConclusionInducing apoptosis is an important mechanism of killing leukemic cells by chemotherapeutic drugs.

【Key words】Apoptosis; Leukemial; Antineoplastic agents

近年来的研究发现白血病的发生和化疗药物导致的白血病细胞死亡，都与细胞凋亡有密切关系。细胞凋亡是基因控制下的细胞主动死亡过程，现已证实几乎所有化疗药物在体内和体外都能通过细胞凋亡机制杀死白血病细胞^［1,2］。化疗药物的抗癌效果不仅取决于药物对靶细胞的直接作用，更在于其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。我们研究了几种常用化疗药物在临床治疗相关剂量下对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞及急性混合性白血病(HAL)细胞的凋亡诱导作用及其与临床预后因素的关系。

对象及方法

一、对象

1.病例选择：我院1997年10月～1998年3月住院的初治ALL及HAL患儿共24例。男13例，女11例；年龄4个月～13岁，平均年龄6岁7个月。根据FAB标准，24例初治患儿全部为ALL，其中L₁型 2例，L₂型 18例，L₃型 4例。23例初诊时进行免疫分型，其中B系19例，T系4例。依据Catovsky双表型急性白血病积分法判定其中4例为HAL。

2.正常对照：共10例，男5例，女5例；年龄1～10岁，平均年龄6岁7个月。骨髓取自骨科畸形矫形手术中的切除骨。

二、主要试剂

1.单克隆抗体: 标记荧光素藻红蛋白(PE)的APO 2.7及IgG₁。纯净的APO 2.7，Bcl-2 (购自Immunotech公司，法国),标记荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)的羊抗鼠二抗 (购自Dako公司，丹麦)。

2.DNA琼脂糖凝胶电泳试剂：溶液1含10 mmol/L的Tris-Cl (pH 7.6),10 mmol/L KCl,10 mmol/L 的MgCl₂; 溶液2含10 mmol/L Tris-Cl (pH7.6), 10 mmol/L 的KCl,10 mmol/L 的MgCl₂, 0.5 mol/L 的NaCl, 0.5%的SDS, 2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA); 5×TBE ,TE , 分子标记物：λ DNA/EcoR I+Hind III(北京中山生物技术公司产品)。

3.其他：毛地黄皂苷为Sigma产品；BFA膜处理剂含0.02 mol/L 的PBS （pH 7.2）45 ml、甲醛10 ml、丙酮45 ml；淋巴细胞分层液（比重：1.077）。

三、方法

1.白血病患儿骨髓单个核细胞悬液制备及培养：取肝素抗凝的骨髓液2～3 ml，用淋巴细胞分层液常规分离单个核细胞，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液约10 ml调整细胞浓度为3×10⁵/ml，加入用生理盐水配制的临床治疗相关剂量的化疗药物0.1 ml，使其终浓度分别为长春新碱(VCR) 1.0 μg/ml，地塞米松(Dex) 5.0 μg/ml,柔红霉素(DNR) 10 μg/ml,阿糖胞苷(Ara-C) 50 μg/ml；生理盐水对照组(自发凋亡组)加入0.1 ml灭菌生理盐水(NS),在37℃，5%CO₂孵箱饱和湿度下培养^［3］。

2.形态学方法检测凋亡：体外培养的白血病细胞经姬姆萨染色和苏木精染色后油镜下观察。

3.DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡：生理盐水对照组，VCR，Dex，Ara-C组白血病细胞体外培养40～44 h和DNR组白血病细胞体外培养20～24 h后收集细胞，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察^［4］。

4.用流式细胞仪检测凋亡细胞的比例：在体外培养24 h的生理盐水对照组、VCR、Dex、Ara-C组白血病细胞，新鲜白血病细胞和正常儿童单个核细胞用毛地黄皂苷破膜后以直接法标记凋亡指示抗体APO 2.7，体外培养的DNR组白血病细胞用毛地黄皂苷破膜后以间接法标记凋亡指示抗体APO 2.7(由于DNR有自发红荧光)。最后用FACscan流式细胞仪进行数据分析^［5］。

5.白血病细胞和正常儿童骨髓单个核细胞Bcl-2的表达：在1×10⁶细胞悬液0.1 ml中加入1%多聚甲醛0.5 ml及BFA膜处理剂各0.5 ml，室温放置5 min后用间接法标记Bcl-2单抗，然后用FACscan流式细胞仪检测。

四、统计学处理

数据应用SPSS统计软件进行配对t检验，成组t检验，方差分析，卡方检验，秩和检验，相关分析及多元逐步回归分析。

结果

一、形态学表现

光镜下细胞凋亡的形态学改变主要是染色质凝聚、核固缩断裂、细胞浆浓缩，但细胞膜保持完整。随化疗药物种类及作用时间的不同，细胞凋亡的形态学改变亦不完全相同，并呈阶段性改变。用临床治疗相关剂量的VCR、Dex、DNR、Ara-C作用20～24 h 后，多数患儿（分别为 22/24、19/24、6/11、6/6）的白血病细胞可出现细胞凋亡的形态学改变，主要是早、中期凋亡细胞，而晚期凋亡细胞极少见。但部分患儿（3/11）的白血病细胞加入DNR培养20～24 h即出现以细胞坏死为主的表现。

二、DNA琼脂糖凝胶电泳表现

用临床治疗相关剂量的不同化疗药物作用于不同患儿的白血病细胞后，在琼脂糖凝胶电泳上出现“梯状”条带(说明发生细胞凋亡)的时间和清晰度有很大差异。多数患儿（6/11）的白血病细胞用DNR作用20～24 h后，凝胶电泳上可出现“梯状”条带，但少部分患儿 （3/11） 的白血病细胞，此时电泳即出现弥漫膜状条带（说明发生细胞坏死）。而应用VCR、Dex、Ara-C作用的白血病细胞约4