【摘要】目的探讨体外同时扩增粒/巨噬细胞系祖细胞（CFU-GM）、巨核细胞系祖细胞（CFU-Mk）的最佳细胞因子组合。方法利用免疫磁珠法分离纯化脐血CD⁺₃₄细胞，在液体培养体系中经干细胞因子（SCF）、白细胞介素（IL）-3、IL-6、粒系集落刺激因子（G-CSF）、FLt-3配基（ FLt-3 ligand，FL）、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）等不同细胞因子组合扩增14 d，检测CFU-GM、CFU-Mk、CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞等的扩增倍数。结果TPO可协同SCF、IL-3、IL-6、G-CSF对CFU-GM、CFU-Mk的扩增作用；FL对造血干细胞/早期祖细胞的支持能力高于TPO；FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-GM (70±7)倍、CFU-Mk (118±10)倍，明显高于SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合对其所扩增的倍数。结论FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合是体外同时扩增CFU-GM和CFU-Mk的最佳细胞因子组合之一。

Synergistic effects of FLt-3 ligand and thrombopoietin on the expansion of hematopoietic progenitor cells in cord blood

LIU Ying^*, LU shangen, PEI Xuetao, et al. ^*

General Hospital of pLA, Beijing 100853, China

【Abstract】ObjectiveTo elucidate the optimal cytokine combinations that would result in the most significantly simultaneous ex vivo expansions of both colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM) and colony forming unit-macrophage(CFU-Mk). MethodsCD⁺₃₄ cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and expanded with various combinations of hematopoietic growth factors (HGFs) which included FLt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), stem cell factor (SCF), IL-3, IL-6 granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), and granulocyte and macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) for 14 days in a liquid culture system. Colony forming cells and antigen expressions were studied by colony forming assays and fluorescence-activated cell sorter (FACS). ResultsTPO showed synergistic actions with SCF, IL-3, IL-6, g-CSF to expand CFU-GM and CFU-Mk. FL showed a stronger potential for expanding hematopoietic stem cells and early progenitor cells than TPO. The combination of FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF increased expasions of CFU-GM and CFU-Mk by 70±7 fold and 118±10 fold, respectively on day 14 of culture, and was much better than the combination of SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF. ConclusionThe combination of FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF might be one of the optimal combinations for significant expansions of CFU-GM and cFU-Mk simultaneously.

【Key words】Thrombopoietin; Membrane glycoproteins; Fetal blood; Hematopoietic stem cell

脐血是新近发展起来的极具潜力的造血干细胞来源，迄今为止世界范围内已进行了600多例脐血造血干细胞移植。由于单份脐血祖细胞绝对数量不足，对于较大儿童或成人则有外周血中性粒细胞，尤其是血小板恢复时间延迟等缺陷^［1］。成功地体外扩增脐血造血细胞是脐血移植应用于较大儿童及成人的关键问题。FLt-3配基（FLt-3 ligand，FL）和促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）为新近发现的两个作用于造血干细胞/早期祖细胞的细胞因子^［2，3］。我们利用FL、TPO与其他常用细胞因子的不同组合对脐血CD⁺₃₄细胞进行体外扩增，探讨体外扩增巨核系和粒/巨噬系祖细胞的最佳细胞因子组合 。

材料和方法

一、脐血

来自解放军总医院妇产科，肝素抗凝终浓度为20 U/ml，平均采集量为50～70 ml， 采集后24 h内的细胞悬液经PBS缓冲液稀释，Ficoll（相对密度1.077）梯度离心。收集界面层单个核细胞（MNC），洗涤备用。

二、脐血CD⁺₃₄细胞的分离

利用Mini MACS免疫磁性系统进行。即抗CD₃₄抗体QBEND -10（Miltenyi Biotec公司， 德国）与细胞悬液1∶5混匀，4℃孵育20 min；1∶5加入羊抗鼠IgG₁免疫磁珠，6～8℃孵育20min，洗涤，制成单细胞悬液。标记细胞通过置于磁场内的分离柱，洗脱去除CD^-₃₄细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD⁺₃₄细胞。

三、脐血CD⁺₃₄细胞体外液体扩增体系

IMDM培养基中含12.5%马血清（HS）、12.5%胎牛血清（FCS）、5×10^-7 mol/L氢化可的松、2×10⁴/ml 的CD⁺₃₄ 细胞及重组人造血细胞生长因子（rhHGFs）的终浓度分别为：FL(Immunex公司，美国)40 ng/ml; TPO(Amgen公司，美国)10 ng/ml; SCF(Sandos公司，美国)50 ng/ml; IL-6(Sandos公司，美国)20 ng/ml; IL-3(Sandos公司，美国)2 ng/ml; GM-CSF(Glaxo公司，美国)40 ng/ml; G-CSF(Amgen公司，美国)20 ng/ml。上述体系接种于12孔板中，1ml/孔，复种3孔，37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养14 d。每周半量换液。rhHGFs每48 h加入体系1次，连续加5次。第14天时取出细胞用于细胞总数、CD⁺₃₄、CD⁺₃₄ CD^-₃₈细胞、粒/巨噬细胞系祖细胞（CFU-GM）及巨核细胞系祖细胞（CFU-Mk）的检测。

四、实验分组

(1)SCF+IL-3+IL-6+TPO；(2)SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF；(3)SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF；(4)FL+SCF+IL-3+IL-6；(5)FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF。用同一份脐血分离出的CD⁺₃₄细胞分别在上述5个组合支持的液体体系中扩增，重复3次。

五、造血祖细胞集落培养

CFC试剂盒（军事医学科学院放射医学研究所）含30％HS、10％牛血清白蛋白（BSA）（Sigma公司，美国）、50 ng/ml 的干细胞因子（SCF）、2 ng/ml 的白细胞介素3（IL-3）、40 ng/ml 粒单集落刺激因子（GM-CSF）、5×10³ U/ml 的粒系集落刺激因子（G-CSF）、2 U/ml 的促红细胞生成素（EPO）(Bochinger公司，美国)、5×10³CD^＋₃₄细胞/ml或5×10⁴扩增细胞/ml、IMDM及1.35%甲基纤维素。上述体系接种于24孔板中，0.5 ml/孔，复种3孔，37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养14 d，计数CFU-GM。CFU-Mk培养体系中细胞因子为SCF 50 ng/ml，IL-3为2 ng/ml和TPO为 10 ng/ml，且加用5×10⁵ mol/L 的2-巯基乙醇，其余条件同前，7～9 d计数CFU-Mk。

六、细胞表面标志的流式细胞仪（FACScan BD，美国）分析

标记抗体鼠抗人CD₃₄单抗 FITC-HPCA-2 （BD公司，美国）和鼠抗人CD₃₈单抗PE-leu17 （BD公司，美国）分别用于检测CD⁺₃₄和CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞，1∶10（5 μl / 5×10⁵细胞）稀释，4℃孵育20 min，洗涤送检。

七、统计学方法

用SAS软件对CFU-GM、CFU-Mk、CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞3个指标的扩增倍数进行随机单位组方差分析；用Student-Newman-Keuls test进行两两比较，显著性水平设为0.05。

结果

一、脐血CD⁺₃₄细胞的分离纯化

MiniMACS分离纯化获得的CD⁺₃₄细胞经FACS检测，其纯度为90.11%～97.57%；回收率62%～75%。

二、TPO对脐血造血祖细胞的扩增作用

TPO和G-CSF分别为巨核细胞系及粒系特异性生长因子。含TPO的SCF+IL-3+ IL-6+TPO组合14 d扩增CFU-Mk (35±5)倍，SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-Mk (32±4)倍，均明显高于不含TPO的SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF组合（4.0±1.0）倍（P＜0.05）；G-CSF加入SCF+IL-3+IL-6+TPO对CFU-Mk的扩增倍数无明显影响（P＞0.05）。SCF+IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF对CFU-GM的扩增能力也明显强于SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF，前者14 d扩增CFU-GM (26±3)倍，后者(12.9±2.2)倍（P＜0.05）。可见，TPO不仅对巨核细胞系祖细胞的增殖有明显作用，还可协同G-CSF刺激粒系造血。G-CSF对TPO诱导巨核细胞系分化无显著影响。

三、FL对脐血早期造血祖细胞的体外扩增作用

CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞包括造血干细胞和早期造血祖细胞，这些细胞对早期造血细胞因子，如SCF、IL-3、IL-6无反应，而FL可诱导它们由静止期进入增殖期^［4］。FL单独作用只有很弱的集落刺激活性，但与SCF、IL-3、IL-6联合具