摘要：目的研究激活Gs蛋白对胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡的影响及作用机制。方法采用原代培养的新生大鼠小脑颗粒神经元，用霍乱毒素（CT）激活Gs蛋白，用二乙酸荧光素(FDA)染色及四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定胆红素诱导的小脑神经元存活率，¹²⁵I放射免疫法测定细胞内环磷酸腺苷（cAMP），Fura-2/AM荧光比值成像技术测定细胞内钙浓度（［Ca²⁺］i）。结果CT诱导细胞内cAMP升高并呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡。当加入腺苷环化酶（AC）刺激剂(Forskolin)及cAMP类似物(8-溴-环磷酸腺苷)后，虽导致细胞内cAMP升高，但不能阻断或减弱胆红素诱导的神经元凋亡。另发现胆红素浓度依赖性触发细胞内钙升高，而CT可降低胆红素导致的细胞内钙的升高。结论Gs蛋白可能参与了小脑颗粒神经元凋亡的调控，激活Gs蛋白拮抗胆红素诱导的神经元凋亡的机制是通过降低细胞内钙而不依赖于cAMP的途径。

Activation of Gs-protein affects apoptosis of rat cerebellar granule neurons induced by bilirubin

LI Xiaoyu

(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)

LIN Suizhen

(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)

XU Xiaolin

(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and the mechanism of activation of Gs-protein on bilirubin-induced apoptosis of rat cerebellar granule neurons.MethodsPrimary cultured rat cerebellar granule neurons were exposed to Cholera toxin (CT). The effect of activation of Gs-protein by CT on bilirubin-induced apoptosis was observed. The survival rate of neurons was detected by fluorescein diacetate (FDA) staining and MTT assay. The intracellular ［Ca²⁺］i was measured by the ratio of fura-2/AM with the microspectrofluorometry ratio imaging system. Cytosolic cyclic AMP（cAMP） content was quantitated by using ¹²⁵I radioimmunoassay.ResultsCT could induce the elevation of cAMP content and protect cerebellar granule neurons from the bilirubin-induced apoptosis in a dose-dependent pattern. However, the exposure of cultured cerebellar granule neurons to Forskolin (which stimulates adenylate cyclase directly and enhances Gs-cyclase coupling) and 8-bromo-cAMP (a membrane-permeable analogue of cAMP) did not block or attenuate apoptosis of cerebellar granule neurons induced by bilirubin. On the other hand, bilirubin elevated ［Ca²⁺］i in a concentration-dependent pattern. CT attenuated the rise of ［Ca²⁺］i induced by bilirubin.ConclusionGs-protein might play a role in the regulation of apoptosis of cerebellar granule neurons. The mechanism of protection against bilirubin-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by activation of Gs-protein was associated with decreasing ［Ca²⁺］i in a cAMP-independent way.

Key words：Bilirubin; G-proteins; Neurons; Apoptosis▲

胆红素脑病是新生儿高胆红素血症中最严重的并发症，常可遗留脑瘫、智力低下等严重后遗症^［1］。有关胆红素神经毒性的分子学发病机制尚不十分清楚。本室已报道胆红素可选择性地诱导新生大鼠小脑颗粒神经元凋亡^［2］，初步揭示了胆红素神经毒性的分子学发病机制。众多研究已发现细胞凋亡与信号传导系统Ca²⁺、cAMP、蛋白激酶C等存在着密切关系，同时激活G蛋白可双相调节大鼠小脑颗粒神经元的凋亡^［3，4］。因此,本研究通过检测细胞存活率、细胞内cAMP的浓度、细胞内Ca²⁺浓度（［Ca²⁺］i）的变化，探讨激活Gs蛋白对胆红素诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响及机制。

材料和方法

一、材料

1．主要试剂：霍乱毒素（cholera toxin，CT）、8-溴-环磷酸腺苷（8-bromo-cAMP）（美国RBI公司），Fura-2/AM、EGTA（美国Molecular Probes公司），神经细胞基础培养液（basal medium eagle′s BME）（美国GIBGO公司），二甲亚砜（DMSO）、胆红素（bilirubin，BR）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、福司柯林（forskolin，FK)等药物（美国Sigma公司）。

2．动物来源：生后8 d的SD大鼠，体重12～16 g，雌雄不限，由中山医科大学实验动物中心提供。

二、方法

1．大鼠小脑颗粒神经元的培养及凋亡模型的建立：按照我室已建立的方法^［2,5］。取生后8 d的SD大鼠的小脑，经过0.5 g/L胰酶消化后制成细胞悬液，加入0.5 g/L胰酶抑制剂和50 mg/L的DNA酶以终止消化，离心5 min(1 500 r/min)，弃上清液，将细胞加入含有10%胎牛血清和25 mmol/L氯化钾的BME中，以1.5×10⁹/L的密度接种于已经用多聚赖氨酸包备的24孔板的培养皿中。接种后24 h加入10 μmol/L的Ara-C以抑制胶质细胞的生长，使神经元的纯化率达到95%以上。细胞在培养皿中培养8 d，加入胆红素3 mg/L后，经Hoechst 33258染色观察细胞核形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳法证实胆红素可诱导小脑颗粒神经元的凋亡^［2］。

2．神经元存活率的测定：(1) 荧光染色法^［5］取培养第8天的神经元加入胆红素3 mg/L后，在不同时间点测定细胞存活率，给药24 h细胞存活率为51%^［2］，故本实验均以给药24 h后测定神经元存活率。每一药物处理组或浓度组及对照组各设3～6个复孔，实验重复3次。方法：去掉培养液, 采用荧光双染色法观察神经元生存状态及形态学变化，并在荧光显微镜下随机拍照。(2)MTT法^［6］：在培养液中加入MTT（250 μg/ml），置5%CO₂、37℃的培养箱中4～6 h，去掉培养液，加入DMSO震荡混匀后，在酶标仪（Elx 800，美国）上测定570 nm和630 nm双波的吸光度。酶标仪测得的吸光度（A值）与细胞存活率呈正相关（r²=0.992）。计算：细胞存活率（%）=处理组A值/对照组A值×100%或直接以测得的A值代表细胞存活率。

3. ［Ca²⁺］i的测定^［7］：采用Fura-2/AM荧光比值成像技术测定［Ca²⁺］i。用培养第8天的细胞，加入3 mg/L 的胆红素3 h后，去除培养基，用含5 g/L小牛白蛋白的缓冲液分别清洗细胞，以清除细胞外的胆红素；经5 μmol/L Fura-2/Am负载45 min后的神经元,洗涤3次,放在倒置荧光显微镜下,使用荧光比值成像系统(Imaging 1/FL，美国), 激发波长为340 nm和380 nm，发射波长为510 nm，在计算机自动控制下测定340/380荧光比值, 根据公式计算出［Ca²⁺］i。

4．细胞内cAMP浓度的测定：采用¹²⁵I标记放射免疫方法测定。按文献^［8］的方法并稍加修改，细胞在24孔板培养8 d，药物处理组及对照组各设8个复孔，加药2 h后弃尽培养基，用冷PBS洗2次，各孔立即加含1%三氯醋酸的70%乙醇溶液（破坏细胞膜和酶的活性，400 μl/孔），置-30℃过夜。再将液体转移到青霉素小瓶中，60～80℃水浴蒸干，每瓶加50 mmol/L醋酸缓冲液400 μl，置-30℃待测。具体操作按上海中医学院提供的¹²⁵I-cAMP试剂盒说明书进行，根据标准曲线回归方程计算出cAMP量，结果以pmol/孔表示。

三、统计学处理

测量数据用均值±标准差(±s)表示，显著性检验采用方差分析及SNK-q检验（用spss 7.0统计软件包）。所测得cAMP浓度为正态分布。

结果

一、激活Gs蛋白对胆红素神经毒性的影响

用培养8 d的大鼠小脑颗粒神经元加入不同浓度的CT（0～4 mg/L）预处理4 h后，再加入3 mg/L胆红素，24 h后测神经元存活率，结果CT在0、2、4 mg/L时神经元的存活率分别为(40.0±2.5)%、(78.0±2.6)%、(95.0±2.7)%(实验重复3次，结果类似)，说明CT呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的神经元死亡（图1～4）。

图1-4神经元的生存状况及形态学变化

(荧光双染色法,绿色为活细胞,红色为死亡细胞光镜×200)

1对照组神经元