摘要目的钙和维生素D(VitD)是影响骨发育的两个重要因素，通过建立雏鸡单纯钙缺乏、VitD缺乏的动物模型，比较两种情况下肥大软骨细胞凋亡的变化。方法该研究在建立不同发育阶段单纯VitD、钙缺乏肉鸡雏鸡动物模型的基础上，采用Tunel原位末端标记检测技术、流式细胞术等方法，从形态、生化及组织学等多方面对VitD缺乏、钙缺乏所致骨生长发育障碍的机制进行了深入的研究。结果正常软骨细胞凋亡发生在终末肥大软骨细胞处，肥大软骨细胞凋亡百分率约为34.7 %。雏鸡单纯钙缺乏对生长板软骨细胞的凋亡无明显影响，VitD缺乏时有生长板软骨细胞的凋亡的减少。结论VitD缺乏、钙缺乏导致骨发育异常的机制可能不同。VitD缺乏导致的肥大软骨细胞凋亡减少可能是VitD缺乏时软骨细胞堆积和软骨层明显增厚的重要原因之一。

Cartilage development disorder of bone growth plate in vitamin D deficient,calcium deficient chicken

WANG Songyan,LI Haiqi,YANG Xiqiang,et al.Affiliated Children′s Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400014

AbstractObjectiveTo observe the chondrocyte development disorder caused by vitamin D (VitD) and calcium deficiency.MethodsChondrocyte apoptosis was documented by using the technique of in situ end-labeling,flow cytometric analysis and DNA fragmentation.Chondrocyte morphologic changes were observed by H-E staining.ResultsThe results showed that 34.7 % of the normal hypertrophic chondrocytes were undergoing apoptosis,the percentage and the location of apoptosis between the calcium deficient group and the control group had no significant difference,but in VitD deficient group the percentage of hypertrophic chondrocytes apoptosis was significantly lower (19.77%).It was also found that there were chondrocytes architectural disarrangement in Vit D deficient group.ConclusionThe study demonstrated that there are different mechanism of bone growth disorder between VitD and calcium deficient chicken.Significantly lower hypertrophic chondrocytes apoptosis may be the main reason of chondrocytes accumulation and cartilage thickning caused by VitD deficiency.

Key wordsChickensCalciumVitamin D deficiencyApoptosisChondrocytes

Bone development

长骨生长板终末肥大软骨细胞凋亡是近几年才得到证据证实其存在，且在长骨发育过程中具有重要意义的生理性过程。终末肥大软骨细胞的凋亡异常将引起骨生长板发育的异常，使骨生长障碍。维生素D（VitD）缺乏和钙缺乏均引起了骨生长的障碍，但两者表现不完全相同。本研究用本实验室已建立的雏鸡VitD缺乏、钙缺乏动物模型，研究单纯VitD缺乏、单纯钙缺乏时雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡的变化。

对象和方法

一、对象及分组

20只雄性肉鸡雏鸡（年龄1周，平均体重为54.3 g）随机分为四组：A组为正常组（饲料中钙含量为9.102 g/kg，VitD为 400 IU/kg）；B组为轻度钙缺乏组（饲料中钙含量6.147 g/kg,VitD 400 IU/kg）；C组为重度钙缺乏组（饲料中钙含量为3.192 g/kg,VitD 400 IU/kg）；D组为VitD缺乏组（饲料中钙含量为9.102 g/kg，不含VitD,且避光喂养）。每组各5只。用配制饲料喂养7周。实验末检测血钙、血离子钙、25(OH)D₃、骨密度、血碱性磷酸酶证实动物模型的成功建立，然后处死动物，取骨作以下检测。

二、实验方法

1.光镜下观察生长板软骨细胞层结构变化:取右侧胫骨近端干骺端，用10％福尔马林固定，经梯度酒精系列脱水，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜观察组织学变化。

2.原位末端标记法观察生长板软骨细胞凋亡：雏鸡胫骨生长板软骨石蜡切片,用Tunel原位末端标记检测试剂盒,按其操作说明进行实验。Tunel 原位末端标记检测技术，利用TdT的修饰作用,将荧光素标记的寡核苷酸填补组织细胞DNA断口，再通过一系列免疫反应显示出来，能对组织中单个细胞的凋亡情况进行定位分析^［1］。

3.流式细胞仪(FACS)检测软骨细胞凋亡：（1）软骨细胞单细胞悬液的制备：按Helmtrud提供方法略加修改^［2］。(2)FACS：将已制备好的软骨细胞单细胞悬液1 ml(调细胞数为1×10⁶/ml)，0.01 mol PBS洗2次，碘化乙锭(PI)＋RNase孵育4℃，45分钟，300目网筛过滤，上流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司FACS Calibar)。用Mod Fit LI-2.0 DNA周期分析软件分析细胞凋亡。流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速定量检测的新技术，可反映不同周期中DNA含量所占比例，且在细胞凋亡，DNA发生片段化时，在正常细胞G₁期前出现另一峰（AP峰），这是凋亡细胞所特有的亚二倍体核型峰，此外，通过计算机分析，还可计算出凋亡细胞的百分率，它较凝胶电泳具有更高的灵敏性，目前它是分析细胞凋亡最常用的先进方法^［3］。

三、数据的统计学处理

采用华西医科大学的医学统计软件包计算机处理。实验数据先进行方差齐性分析，然后再进行各组间两两比较；q=0.05。

结果

一、钙缺乏、VitD缺乏时鸡长骨干骺端生长板软骨的形态学变化

光镜下可见，VitD缺乏雏鸡其长骨生长板软骨增殖层和肥大层增厚异常显著，且有软骨细胞的排列紊乱，形态异常，低钙B组、C组也可见增殖层和肥大层的增厚，C组较B组增厚明显，但两者轻于D组，未见软骨排列紊乱（图1～3）。

二、原位末端标记观察生长板软骨细胞凋亡

光镜下可见正常肥大软骨细胞凋亡出现在终末肥大软骨细胞的位置，即在软骨细胞与骨松质交界处，也可见血管周的软骨细胞凋亡。B、C组雏鸡长骨生长板的软骨细胞凋亡与A组相似。D组偶见血管周的肥大软骨细胞凋亡（图4～6）。

三、流式细胞仪检测软骨细胞凋亡

各组流式细胞DNA直方图均出现双峰，第1峰为亚二倍体峰，即AP峰；第2峰为二倍体峰。A组、B、C组双峰形状相似，D组AP峰明显低于其他各组。根据Mod Fit LI-2.0 DNA周期分析软件分析所得的凋亡细胞百分率显示A组为(34.7±8.45) %，D组(19.8±5.8)%,D与A组相比差异有显著性(P＜0.05); B组为（30.1±7.2）%、C组为(33.5±7.4)与A组比较差异无显著性（图7）。

AP峰为凋亡细胞所特有的亚二倍体峰，图中A、B、C、D分别表示

a、B、C、D组的流式细胞DNA直方图，可见A组、B、C组双峰形状相似，而D组AP峰明显低于其他各组图7四组流式细胞DNA直方图

讨论一、正常雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞的凋亡

长骨生长主要通过长骨干骺端生长板软骨生长、基质形成和软骨钙化三者良好的平衡产生。对软骨发育中肥大软骨细胞的归宿一直存有两种观点。有些学者认为肥大软骨细胞是软骨细胞的终末细胞，最终退化死亡；另一些学者认为在软骨内成骨过程中肥大软骨细胞均分化为成骨细胞^［4］。近年来越来越多的研究表明，肥大软骨细胞主要通过凋亡退化^［5，6］。本研究用 DNA凝胶电泳证实了软骨细胞凋亡的存在，同时Tunel原位凋亡检测显示正常肥大软骨细胞的凋亡出现在终末肥大软骨细胞靠近软骨矿化和血管吸收的位置。这与近年来相关的文献报道一致。证明肥大软骨细胞凋亡确为软骨细胞的重要归宿。

在特定生长阶段，软骨细胞柱的长度和细胞数量被精确调控。软骨细胞增生的速度、程序性细胞死亡的速度、生长阻滞程度直接影响生长板软骨细胞数量。在生长过程中，增殖软骨细胞分化为肥大软骨细胞的速度在不同的年龄阶段因长骨的生长速度的不同而不同，软骨生长速度随之也不同。因此对不同生长阶段的长骨生长板软骨细胞，其增殖程度和程序性死亡的速度不同。Farnum等^［7］用电镜观察到猪的生长板终末肥大软骨细胞有20%～30%显示凋亡早期的细胞形态。Gary等^［5］对17～18天鸡胚胸骨的研究发现，15%以上包括初级骨化中心在内的软骨细胞和50%吸收血管系统接着面的软骨细胞表现浓缩的形态。而Masashi等^［8］对8周白岩鸡胫骨生长板软骨细胞层的研究显示，凋亡细胞占整个软骨细胞层的8%～12%。本实验流式细胞结果分析表明，8周正常肉鸡雏鸡生长板终末软骨细胞凋亡占肥大软骨细胞的34.7%左右。

二、单纯钙缺乏对雏鸡长骨生长板软骨细胞凋亡的影响

单纯钙缺乏引起了骨矿化障碍、骨质疏松。Kaastad等^［9］发现低钙摄入主要引起鼠骨质疏松症，骨体积降低30%，骨钙含量下降，轻度软骨堆积，与本研究的结果一致。但单纯钙缺乏引起<