【摘要】目的研究含人胚胎骨髓基质细胞层体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果。方法分别建立人胚胎骨髓基质细胞层（FBMSCL）和成人骨髓基质细胞层（ABMSCL），观察他们单独及其与造血生长因子（HGFs）联合，在不同时间（第10、21、30、38天）对脐血CD⁺₃₄细胞、CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞、粒单系祖细胞（CFU-GM），多向祖细胞（CFU-GEMM），早期红系祖细胞（BFU-E）的扩增作用。结果(1)人胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)单独作用及其与HGFs［包括脐血浆、干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-6、白细胞介素1β(IL-1β)，促红细胞生成素(EPO)、粒细胞刺激因子(G-CSF)］联合作用于CD⁺₃₄细胞、集落形成细胞(CFCs)，其扩增效果均优于成人骨髓基质细胞(ABMSC)。(2)FBMSC+HGFs在其扩增高峰(第30天)所扩增的早中期祖细胞的百分含量明显高于ABMSC+HGFs在其扩增高峰(第30天)所扩增的早中期祖细胞百分含量。(3)FBMSC+HGFs扩增CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞达3倍，ABMSC+HGFs对CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞数量起维持作用，当扩增到第5～6周，CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞并没有被耗竭，仍分别占75%和25%。结论含人胚胎骨髓基质细胞层体系是较理想的脐血造血干/祖细胞仿体内扩增体系之一。

The effect of human fetal bone marrow stromal cells on the expansion of hematopoietic stem cells/progenitor cells in umbilical cord bloodSU Ruijun, HUANG Shaoliang, ZHOU Dunhua, et al. SUN Yet-sen Memorial Hospital, Zhongshan University of Medical Sciences, Guangzhou 510120

【Abstract】ObjectiveTo study the expansion effect of human fetal bone marrow cells system on the hematopoietic stem cells in umbilical cord blood.MethodsFetal bone marrow stromal cell layers (FBMSCL) and adult bone marrow stromal cell layers (ABMSCL) were established and their single and combined effects with hematopoietic growth factors (HGFs) on expansion of colony forming cells (CFCs), CD⁺₃₄ cells and CD⁺₃₄CD^-₃₈ cells in umbilical cord blood were observed at different time (day 10,21,30,38).Results(1) The expansion effect of FBMSCL on the CD⁺₃₄ Cells and CFCs was better than ABMSCL′s and was also better than ABMSC′s when they were combined with HGFs (including umbilical cord blood plasma, SCF, IL-3, IL-6, IL-1 β, EPO, G-CSF), respectively. (2) During the CFCs peak on day 30, the percentage of early and mid-term progenitors expanded by FBMSCL+HGFs was higher than that expanded by ABMSCL+HGFs. (3) The CD⁺₃₄CD^-₃₈ cells were three folds expanded by FBMSCL+HGFs and were not changed significantly by ABMSCL+HGFs. When they were expanded on the fifth to sixth week, CD⁺₃₄CD^-₃₈ cells were not wasted up. There were 75% and 25% CD⁺₃₄CD^-₃₈ cells supported by FBMSCL+HGFs and ABMSCL+HGFs, respectively.ConclusionHuman fetal bone marrow stromal cells system is one of the ideal expansion systems of hematopoietic stem/progenitor cells in umbilical cord blood.

【Key words】Bone marrow cellsHematopoietic cell growth factorsHematopoietic stem cells

自1989年第一例脐血移植治疗Fanconi贫血患儿获得成功以来，至今已有500多例脐血移植治疗恶性肿瘤及恶性血液病，80%获得成功，所涉及的疾病有30余种。由于单份脐血采集量和（或）干／祖细胞数不足以应用于成人移植和基因治疗，脐血干／祖细胞的扩增研究日益受到重视。其中，寻找一种扩增效率高，且异基因免疫原表达弱的基质细胞具有重要的实用价值。最近作者等发现人胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）无血清培养上清对成人骨髓中集落形成细胞（CFCs）生长的刺激作用明显优于成人骨髓基质细胞（ABMSC）无血清培养上清的作用，胚胎细胞免疫原性弱。因此，我们拟利用 FBMSC建立一种仿体内扩增培养体系，对脐血CD⁺₃₄细胞、CD⁺₃₄CD^-₃₈细胞及粒单系祖细胞（CFU-GM）、多向祖细胞（CFU-GEMM）、早期红系祖细胞（BFU-E）等进行体外扩增，以探讨含人胚胎骨髓基质细胞层（FBMSCL）对脐血干／祖细胞的扩增效果。

材料及方法

一、实验材料

1.胚胎骨髓：胚胎骨髓取自本院妇产科。取水囊引产无病理情况的胚胎的股骨和胫骨。

2.成人骨髓：成人骨髓取自本院胸外科手术切除的肋骨（无血液病及其他原发病累及者的骨髓）。

3.脐血：脐血取自本院产房及中山医科大学附属第一医院产房。母亲及新生儿均无疾病的足月顺产儿的脐血。用装有ACD-A抗凝剂的采血袋收集。

胚胎、成人骨髓及脐血在采集12小时内均按本室方法制成单个核细胞(MNC)悬液备用^［1］。

二、实验方法

1.胚胎／成人骨髓基质细胞层的培养：以成纤维细胞为主的混合基质细胞体外培养体系(4 ml)：伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)培养液(Sigma公司)中加入20%胎牛血清(FCS，GIBCO公司)(V/V)，氢化可的松（扬州制药厂）0.04 ml（终浓度10^-6mol/L），α-ME（德国Merk公司）(10^-4mol/L) 20 μl，MNC浓度2×10⁶/ml。将上述体系接种于25 ml容积培养瓶（Falcon）中，放置于37℃含5%CO₂的培养箱内孵育，每周半量换液1次。贴壁细胞铺满90％～95％的培养瓶底面时，用0.05%胰酶(Gibco公司)1 ml加入培养瓶中，将贴壁细胞移种于24 孔板，留空4～6孔，24～48小时后，当成纤维细胞在24孔板重新铺满时，用10 Gy X线照射细胞，第2天即可接种脐血造血细胞（预实验中，给骨髓基质细胞以10 Gy X线照射，取出基质细胞做集落培养，未发现造血细胞集落生长）。

2.接种脐血造血细胞及建立仿体内扩增体系：将不同个体的2～3份脐血混合，制成MNC悬液后，在铺满基质细胞并经X线照射的孔板上划分4个实验组(各4孔)，每孔加入1×10⁵/ml的脐血MNC。4个实验组的扩增体系如下：(1)胚胎骨髓基质层扩增体系(1 ml/孔，n=10)；⑵成人骨髓基质层扩增体系(1 ml/孔，n=10)。上述两组均含脐血MNC 1×10⁵/ml 和以成纤维细胞为主混合基质细胞体外培养体系；(3)胚胎骨髓基质层＋细胞因子扩增体系(1 ml/孔，n=10)；(4)成人骨髓基质层＋细胞因子扩增体系(1 ml/孔，n=10)。上述两组均含脐血MNC 1×10⁵/ml、FCS 10%、白细胞介素1β（IL-1β，美国Santa Cruz Biotech公司）40 ng/ml、IL-3 20 ng/ml、IL-6 50 ng/ml、干细胞因子（SCF）50 ng/ml、粒细胞刺激因子（G-CSF）100 ng/ml(日本Kirin公司)生产。促红细胞生成素(EPO，美国Amgem生产)2 U/ml、脐血浆20%，用IMDM补足至1 ml/孔。将上述各扩增体系置入37℃、5%CO₂条件下培养，每2～3天给扩增体系半量换液。

3.CD⁺₃₄细胞以及CD⁺₃₄细胞亚群（CD⁺₃₄CD^-₃₈）的分析：于扩增前（即0天）及扩增后第10、21、30、38天， 在4个扩增组中各取出1孔细胞，用流式细胞术(FACS)检测细胞表面抗原CD⁺₃₄、CD⁺₃₄CD^-₃₈的含量。收获有基质层的孔内细胞，先将非贴壁细胞吸出，用0.05%胰酶(GIBCO)0.25 ml将贴壁层消化，吹打为MNC悬液。再将此悬液置于25 cm²的培养瓶底面，使每5×10⁶细胞悬浮于5 ml含20%小牛血清的IMDM培养液中，置于5%CO₂，37℃，1小时后收获上层的非贴壁细胞，作为粘附于贴壁层的非贴壁细胞，与首次吸出的非贴壁细胞混合，即为收获的扩增后细胞。制成悬液，即可做抗原测定。根据标记的抗原数目不同分为：(1)单标记组：标记抗体为藻红蛋白荧光素（PE）结合的CD₃₄抗体，对照为IgG₁-PE。抗体以1∶10(10 μl/1×10⁶)的MNC稀释，4℃孵育20～25分钟，用标准缓冲液（PBS）洗涤两次，重新悬浮；(2)双标记组：标记抗体为PE结合的CD₃₄抗体和异硫氢基荧光素（FITC）标记的CD₃₈抗体，对照为IgG₁-PE和IgG₁-FITC，以上述方法处理。以上抗体均为丹麦Dako公司生产。单标记组细胞根据PE荧光激发特性进行单标记参数分析，双标记组根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。所用流式细胞仪为FACScan，分析软件为Cell Quest Version 1.2，每个样品细胞数≥5×10⁴的MNC。

4.造血祖细胞培养：将上述同样方法收获的不同时间的扩增后细胞制成单个核细胞悬液，按本室方法分别行CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E培养^［1，2］。第7天计数CFU-GM，第14天计数CFU