【摘要】目的探索转B7-1基因治疗白血病的可能性。方法通过逆转录多聚酶键反应(RT-PCR)获得人B7-1 cDNA，经酶切后克隆至逆转录病毒载体PLXSN，用磷酸钙沉淀法将其导入包装细胞PA 317，获高效表达B7-1的重组病毒，用重组病毒感染人白血病细胞株K 562和HL 60，获得稳定表达B7-1分子的肿瘤细胞，将其与人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，检测³HTdR掺入和细胞因子白细胞介素2(IL-2)和γ-干扰素(INF-γ)的表达。结果B7⁺K 562、B7⁺-1HL60较载体修饰K 562(neo-K 562)、野生型K 562(Wild-K 562)和nco-HL-60、Wild-HL-60组HTdR掺入明显增强，B7⁺K 562组为3 680 cpm、neo-K 562组为645 cpm、Wild-K 562组为866 cpm、B7⁺HL60组为3 980 cpm、neo-HL 60组为486 cpm、Wild-HL-60组为742 cpm。转B7-1基因的白血病细胞能诱导PBMC产生IL-2及IFN-γ。结论转B7-1基因的肿瘤细胞能促进T细胞增殖和分化，推测可能进一步诱导细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性，为在临床开展转B7-1基因治疗小儿白血病打下基础。

Construction of the recombinant B7-1 retroviral vector and its effect on the function of T cellsHUANG Guiqing, LI Chengrong, ZHAO Xiaodong, et al. Children′s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014

【Abstract】ObjectiveTo explore the possibility of transferring B7-1 gene for the treatment of leukemia.MethodsB7-1 cDNA was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction and recombined to retroviral vector pLXSN. Calcium phosphate-DNA precipitation method was used to transfer PLB 7-1 SN into packaging cells PA317. Human leukemia cells K 562 and HL-60 were infected with higher titer virus. B7-1 protein expression was confirmed by FACS technique. After PBMCs from healthy donor were cultured with B7-1⁺ K 562 or B7-1⁺ HL60, ³HTdR incorporation and IL-2 and IFN-γ expression were determined. ResultsA significantly increased ³HTdR incorporation in B7-1⁺ leukemia cell groups was observed (3 680 cpm in K 562 and 3 980 cpm in HL60, respectively) as compared with those in B7 leukemia cell groups (645 cpm in neo-K 562, 866 cpm in Wild-K 562 and 486 cpm in neo-HL-60, 742 cpm in Wild-HL-60). Interleukin-2 and Interferon-γ expressions were found in PBMC cultured with B7-1 transfected K 562 and HL-60 cell lines, but not found in those cultured with wild or neo-cell lines.ConclusionB7-1 transfected K 562 and HL-60 cell lines could induce the proliferation and differentiation of the T cells. It is likely that B7-1 transfected cells may be capable of inducing the activity of cytotoxic T lymphocyte, and that B7-1 transgene therapy is possible for the treatment of leukemia in childhood.

【Key words】RetroviridoeLeukemiaT-lymphocytesAntigent, CD80

B7-1(CD₈₀)是存在于抗原提呈细胞(APC)膜上的糖蛋白分子，与T细胞表面的CD₂₈结合能协同细胞免疫反应、促进T细胞增殖、产生白细胞介素α(IL-2)等淋巴因子。自B7分子首次被报道以来，转B7基因治疗恶性肿瘤一直为肿瘤免疫的研究热点之一。为研究转B7基因治疗白血病的可行性，本研究构建了重组B7-1逆转录病毒载体，并就B7-1基因对T细胞增殖和细胞因子表达的影响进行了初步研究。

材料和方法

一、试剂和细胞株

Oligo(dT)₁₅。MLv-RT，dNTP，Taq酶及各种限制性内切酶均为Gibco公司产品。丝裂霉素c购自Promega公司，鼠抗人CD 80(anti-B7-1)购自美国Ancell公司，FITC-羊抗鼠免疫球蛋白购自成都华美公司，白血病细胞株K 562及HL-60由重庆医科大学汤为学教授赠送，NIH3T3细胞及EB病毒株B958购自重庆医科大学病理生理教研室，PA 317细胞由第三军医大学分子生物学教研室刘昕博士赠送。EBV转化的B淋巴细胞株由我室制备。

二、构建重组B7-1逆转录病毒载体

1.B7-1cDNA的克隆：从EBV转化的B淋巴细胞中提取总RNA，经逆转录酶合成cDNA，根据基因库报道的B7-1序列设计两对引物^［1］。用巢式聚合酶链反应技术(PCR)方法合成B7-1cDNA。

2.克隆B7-1基因到逆转录病毒载体：用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切B7-1基因及逆转录病毒载体由Miller(USA)赠送，T4连结酶连结并转染人大肠杆菌Mc1061，筛选阳性菌落，PCR和酶切鉴定B7-1阳性克隆。用碱裂变法扩增纯化质粒PLB7SN。

3.B7-1基因测序：采用双脱氧测序法，全自动测序仪ABI Prism 377测序。

4.病毒包装及滴度检测：用磷酸钙沉淀法^［2］转染PLB7SN和对照逆转录病毒载体人包装细胞PA 317，G 418筛选阳性克隆。病毒上清感染NTH 3T3细胞，G 418筛选，8天后计数克隆数，所获重组病毒滴度为2×10⁵ CFU/ml。

5.感染肿瘤细胞：用重组B7-1病毒上清2 ml感染HL-60和K 562，同时以空载体LXSN作对照，G 418筛选阳性克隆，获抗G 418的阳性克隆株B7-1⁺ HL-60，neo-HL-60(转空载体细胞)，B7-1⁺ K562和neo-k 562，RT-PCR方法检测B7-1 mRNA表达，流式细胞仪(FACS)检测B7-1蛋白表达^［3］。

三、转B7-1基因肿瘤细胞对T细胞功能的影响

1.以淋巴细胞分离液从正常肝素抗凝血分离外周血单个核细胞(PBMC)，用丝裂霉素C(40 μg/L×10⁶ 37℃,1小时)^［4］处理的肿瘤细胞［B7⁺K 562，载体修饰(neo)-K 562，野生型(wild)-K 562，野生型细胞)］及B7⁺HL-60,neo-HL-60，wild-HL-60)作为刺激细胞，加PBMC(1×10⁵/孔)于55孔培养板，分别加入各种刺激细胞(1×10⁴/孔)，37℃，5%CO₂培养5天，加³HTdR(1 μci/孔)后继续培养16小时，收集细胞测定HTdR掺入值。

2.取1×10⁶PBMC(1 ml)于24孔板，分别加入丝裂霉素c处理的肿瘤细胞1×10⁵/孔(100 μl)，混匀后置37℃、5%CO₂培养，培养后12、24、48小时收集细胞提取总RNA，用RT-PCR测IL-2和IFN-γ基因表达。IL-2和IFN-γ引物合成及PCR程序参照文献［5］。同时用β-actin PCR作为RNA内部质控。

结果

一、重组B7-1逆转录病毒载体的构建

利用巢式PCR方法从EBV-B淋巴细胞中获得B7-1基因(875 bp)，纯化后连结到逆转录病毒载体，分别用DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及SacⅠ酶切，电泳观察。BamHⅠ消化后得一条带，显示质粒环已打开，BamHⅠ，EcoRⅠ消化后得载体(5.8 kb)及B7基因(875 bp)两条带，重组体有两个SacⅠ酶切位点，用其酶切后得三条带，分别为1.7 kb，1.9 kb，3.1 kb(图1)。PCR检测质粒有B7-1基因表达。用抗CD 80(AntiB7-1)单克隆抗体经FACS检测B7-1蛋白表达，发现B7⁺细胞有B7-1蛋白表达，而转染空载体及野生型细胞无B7-1分子表达(图2，3)。

1.Φ×174分子量标记；2.B7_-1 PCR扩增产物；

3.EBU转化B细胞B7_-1扩增产物；4.EcoRⅠ和BamHI消化B7_-1-PLXSN；

5.Bam HI消化-B7_-1-PLXSN；6.Sac Ⅰ消化B7_-1-PLXSN；

7.未消化的B7_-1-PLXSN；8.入DNA/Hind Ⅲ分子量标记

图1B7_-1-PLXSN酶切图

图2流式细胞仪检测B7⁺_-1细胞B7_-1分子表达

图3流式细胞仪检测野生型肿瘤细胞B7_-1分子表达

二、³HTdR掺入结果

通过肿瘤细胞与PBMC混合培养，B7⁺ K 562、B7⁺HL60较neo-K 562、Wild-K 562和neo-HL60、Wild-HL60组HTdR掺入值明显增加，B7⁺K 562组为3680 cpm，neo-K 562组为645 cpm，Wild-K 562组为866 cpm，B7HL60组为3980 cpm，neo-HL60组为486 cpm，Wild-HL60组为742 cpm，结果以直方图表示(图4)。