【摘要】目的进一步提高糖皮质激素(GC)预防新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)的效果。方法 用溶液杂交技术观察血小板源生长因子(PDGF)及其受体(PDGFR)mRNA在大鼠不同成熟阶段肺中的表达，以及GC对二者在肺内表达的调节。结果(1)PDGF-BB、PDGFR-α mRNA随胎龄增长而增高，高峰在19～21天，新生时表达减少，成年时又增高到接近胚胎晚期水平；PDGF-AA和PDGFR-β mRNA在胚胎晚期、新生与成年鼠肺中均有表达，不随胎龄增长而变化，肺内PDGFR-β的表达高于PDGFR-α。(2)GC可上调18天胎肺中PDGF-BB、PDGFR-α mRNA的表达，而下调19、21天胎肺中它们的表达。GC对胎鼠肺组织PDGF-AA、PDGFR-βmRNA的表达无明显影响。结论PDGF与PDGFR mRNA随胎龄增长而变化，与胎肺发育密切相关；GC对大鼠未成熟肺PDGF-BB及PDGFR-α的基因表达有调节作用，在胎肺发育过程中激素与生长因子间有某种联系，以维持胚胎肺的正常发育。

The effects of glucocorticoid on platelet-derived growth factor mRNA expression in fetal rat lungsCHEN Ling, YANG Yi, JIN Qinli, et al. Institute of Pediatrics, Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

【Abstract】ObjectiveTo study (1) differential expressions of platelet-derived growth factor (PDGF) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) mRNA and (2) regulation of dexamethasone (Dex) on the expression of these growth factors in late lung development of fetal rats.MethodsRNase protection assays were used to study mRNA expressions of PDGF-AA PDGF-BB chains and their cognate receptors during late lung development in fetal rats. The mRNA was extracted from lungs of 18,19 and 21 days of gestation (term=22 days), newborn and adult rats. By serum free cultures of fetal lung explants, the effects of Dex on PDGF′s expression were also investigated.ResultsExpressions of pDGF-BB chain and PDGFR-αmRNA were low at the pseudoglandular stage of day 18, reached the peak level at the canalicular stage of day 19 and the sacculate stage of day 21 of gestations, fell again in newborn rats, and then increased in adult rats. Expressions of PDGF-AA chain and pDGFR-β mRNA did not change significantly with the advancing gestation. The expression of PDGFR-β appeared to be more than that of PDGFR-α in late fetal rat lungs. Dex could regulate mRNA expressions of PDGF-BB and PDGFR-α chains, but did not show significant effect on mRNA expression of PDGF-A and PDGF-β chains in late fetal rat lungs.ConclusionThe expressions of PDGF and PDGFR were associated with the development of rat lungs, and changed at different stages of gestation. Glucocorticoid can regulate the gene expressions of PDGF-BB and pDGFR-α chain in fetal rat lungs.

【Key words】GlucocorticoidsPlatelet-derived growth factorRNA, messengerGene expressionRatsLung

新生儿呼吸窘迫综合征(newborn respiratory distress syndrome, NRDS)是新生儿时期重要死因之一。研究表明糖皮质激素(glucocorticoid, GC)有预防NRDS的作用，但临床应用效果不十分理想，机理也不尽清楚，可能有生长因子参与的作用。国外研究血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)对胎肺发育起重要作用，国内未见报道。GC对肺组织，尤其是胎肺组织PDGF表达的调节也未见报道。本研究探讨GC促进肺成熟的机理，为今后临床防治NRDS提供一定的实验与理论依据。

材料和方法

一、实验大鼠

清洁级孕18、19、21天(足月22天)、新生及成年大鼠，体重分别为0.9～1.0 g，1.3～1.5 g，3.0～3.5 g，5.0～6.0 g及220～250 g。

二、肺总RNA提取

分别将18、19、21天孕鼠迅速处死，低温无菌条件下剖宫取出胎鼠分离肺组织(新生及成年鼠处死后直接分离肺组织)，快速剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块，匀浆。用异硫氰酸胍一步法抽提肺总RNA；部分组织块用无血清培养(wayonuth′s培养液)，并加入刺激物地塞米松(Dex)(10^-7 mol/L)置37℃ CO₂箱内(95%空气，5%CO₂)培养48小时后，同法提肺总RNA。经吸光度测定，计算含量。

三、探针来源及标记

大鼠PDGF-AA(Sal Ⅰ-EcoRⅠ 233 bp)、PDGF-BB(BamHI-EcoRI 398 bp)、血小板源生长因子受体(PDGFR)-α(EcoRI-BamHI 348 bp)、PDGFR-β(pstI-EcoRI 478 bp)cDNA探针由加拿大Martin Post博士惠赠。将克隆有cDNA探针的质粒酶切线性化后，经酚、氯仿：异戊醇(24∶1)抽提纯化，无水乙醇沉淀并离心回收。采用Riboprobe Gemini Ⅱ core system试剂盒(Promega产品)和α³²P-UTP(Amersham)合成及标记反意义链RNA探针。

四、溶液杂交

准确定量RNA样品20 μg，经无水乙醇沉淀、离心回收后，加于含2×10 cpm ³²P标记的RNA探针的25%甲酰胺的杂交液中，45℃杂交过夜。次日在各反应管中加入RNase，酶解去除未杂交的单链RNA。抗RNase的杂交片段经8%聚丙烯酰胺变性凝胶(含8 mol/L尿素)电泳分离。电泳胶以保鲜膜覆盖后，与Kodak x-o-mat胶片-70℃放射自显影。

五、杂交结果的定量分析和统计学处理

放射自显影的X线经MIAS-300医用图像分析系统处理得灰度值。所得结果用q检验进行统计学分析。

以上从RNA提取到杂交的整个试验过程至少重复3次，并以GAPDH(Sau3AI-BstxI 110 bp)探针同时杂交作为内参。

结果

一、PDGF与PDGFR mRNA在大鼠未成熟肺、新生鼠及成年鼠肺中的表达

大鼠胎肺PDGF-BB及PDGFR-α mRNA随胎龄增长而增高，新生时下降，成年时又增高(P＜0.05)；PDGFR-β及PDGF-AA mRNA随鼠龄增长无显著性变化；PDGFR-β mRNA明显高于PDGFR-α mRNA(q=5.20，P＜0.05)(图1)。

图1PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFR-α及PDGFR-β mRNA

在不同龄大鼠肺中的表达

二、Dex对大鼠未成熟肺、新生鼠及成年鼠肺中PDGF与PDGFR mRNA表达的调节

Dex对18天及新生鼠中PDGF-BB、PDGFR-α mRNA的表达起上调作用，而对19天与21天胎肺中的表达起下调作用，成年鼠肺中无明显变化；Dex对PDGF-AA、PDGFR-β mRNA在各年龄组中的表达均无明显影响(图2，3)。

图2Dex刺激不同胎龄大鼠肺PDGF-BB mRNA的变化

图3Dex刺激不同胎龄大鼠肺PDGFR-α mRNA的变化

讨论

大鼠晚期胎肺(17～22天)生长发育依次经历腺体期(17～18天，气道发育)，小管期(19～20天，肺呼吸部分发育、间质内血管形成增加)及囊泡期(21～22天，呼吸区域分化增加)，并经历多种变化以满足出生后的气体交换。PDGF是胚胎肺发育过程中重要的调节因子，由A、B二条氨基酸链经二硫键形成二聚体，有三种形式：PDGF-AA、PDGF-BB与PDGF-AB，但后者在胎肺发育中不存在或检测不到。PDGF通过PDGFR发挥生物效应，受体亦有PDGFR-α，PDGFR-β与PDGFR-α β三种。PDGF与PDGFR的表达在肺发育过程中的变化与肺发育阶段有关。

在研究中我们观察到(1)PDGF-AA在晚期胎肺表达，不随胎龄增长而变化；PDGFR-α在小管及囊泡期表达增高。这与国外报道的PDGF-AA、PDGFR-α在肺成纤维细胞^［1］或在上皮细胞^［2］中的表达较一致。PDGF-AA主要影响胚胎早期(12～14天)肺支气管分枝，胚胎晚期肺支气管分枝趋于稳定，PDGF-AA呈现低量表达。(2)PDGF-BB在肺发育的小管期和囊泡早期出现表达高峰；PDGFR-β随胎龄增长无明显变化。这与Buch等^［3］用RNA印迹法观察的结果相类似。PDGF-BB对胚胎晚期(19～22天)肺发育影响较大，主要影响上皮的生长、细胞分化。PDGF-BB在小管期表达增多，表明它在此期有特殊作用，可能与呼吸道上皮出现或控制肺血管形成有关。(3)在胚胎晚期肺PDGFR-β mRNA较PDGFR-α mRNA丰富，这与Han等^［4］观察的结果相一致，可能与PDGFR-β介导整个肺器官生长的作用有一定关系。由上可见PDGF-AA不随胎龄增长而变化，但PDGFR-α则依胎龄变化有不同表达；PDGF-BB随胎龄增加表达增加，而PDGFR-β不随胎龄增长而变化，提示PDGF-AA与PDGFR-α、PDGF-BB与