【摘要】目的探讨抗巨细胞病毒(CMV)药物对CMV感染所致细胞凋亡的影响。方法将大蒜素作用于CMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL)，经凋亡原位末端标记检测和DNA含量流式细胞仪检测。结果发现大蒜素用药组细胞凋亡发生率低于未用药的病毒感染对照组，但二者差异无显著意义(P＞0.05)；进一步经原位分子杂交检测和图像分析发现，虽然与病毒感染组相比，大蒜素用药组HEL细胞内bcl-2基因的表达有所增加，fas基因表达减少；但与正常HEL细胞组比较，bcl-2基因的表达仍是明显减低，fas基因表达亦是明显增高的(P＜0.01)。结论大蒜素能影响CMV感染所致的细胞凋亡，但作用较弱。用同样的方法，又对比了更昔洛韦用药组，结果提示更昔洛韦能有效地抑制CMV所诱导的HEL细胞凋亡的发生。

The inhibitory effect of garlicin and ganciclovir on CMV-induced apoptosis in vitroLI Hong, DONG Yongsui, FANG Feng, et al. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University. wuhan, 430030

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of garlicin and ganciclovir on CMV-induced apoptosis.MethodsThe authors detected the cMV-infected human embryonic lung (HEL) fibroblast cells after adding garlicin and ganciclovir with in situ end-labeling (TUNEL) apoptotic cell detection method and flow cytometric cell cycle analysis; they also investigated the expressions of bcl-2 and fas mRNA by means of in situ hybridization techniques and image analysis system.ResultsThere was little change in cMV-induced apoptosis in the group of garlicin. Meanwhile, bcl-2 was upregulated and fas was downregulated compared with the CMV-infected control, but both of them were different from the normal control significantly.ConclusionThe effect of garlicin on CMV-induced apoptosis was weak. Nevertheless, ganciclovir could inhibit CMV-induced apoptosis effectively.

【Key words】CytomegalovirusApoptosisGenes, bcl-2DisulfidesGanciclovir

巨细胞病毒(CMV)感染在世界范围内广为传播，至今仍缺乏安全高效的抗CMV药物。通过抗CMV药物的体外实验研究，我们筛选出大蒜素及更昔洛韦(GCV)对CMV AD₁₆₉和临床分离株均有明显抑制作用。更昔洛韦作为一种化学制剂，其抗CMV作用机理已十分明确，即它被CMV感染的细胞产生的GCV-三磷酸盐(GCV-TP)诱导活化，而发挥对CMV DNA多聚酶的抑制作用。而大蒜素这一中药制剂，由于其组成成分的复杂性，使其抗病毒作用机理难以阐明。我们通过检测药物对CMV感染所致细胞凋亡的影响，以期从细胞凋亡这一角度对大蒜素的抗CMV机理加以阐述。

材料和方法

一、材料

1.细胞：自制人胚肺成纤维细胞(HEL)，取自妊娠4个月水囊引产的胚胎，经常规原代细胞培养方法，制成单层细胞，第10～20代用于本实验。

2.标准病毒株：CMV AD₁₆₉病毒株，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。

3.临床分离株：从CMV性肝炎患儿及无症状感染者尿中分离的CMV 7株(来自不同患婴)，传代次数少于10代，分别编号H₁，H₂，H₃，H₄，H₅，H₆，H₇。

4.药物：大蒜素，由湖北医科大学药房生产，批号951044。更昔洛韦，由湖北省医药工业研究所提供。

5.探针来源：含bcl-2 cDNA及fas-cDNA片段的质粒由同济医科大学免疫教研室惠赠。bcl-2 cDNA片段长度为2.0 kb，于EcoR Ⅰ单酶切位点插入载体Bluescript质粒中，经氯化钙渗透法转化入JM101菌株；fas-cDNA片段长度为2.3 kb，于BamHI及XBal酶切位点插入载体pUC18，经氯化钙渗透法转化TG₁菌株，再按常规方法提取质粒DNA，经酶切，回收，纯化后，获得bcl-2及fas cDNA探针。

6.试剂：抗巨细胞病毒即刻早期抗原(CMV-IEA)单抗由美国UAB儿童医院Britt教授提供(1∶100)；细胞凋亡原位检测试剂盒及地高辛标记检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。

二、方法

1.细胞毒性实验：根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物细胞毒性^［1］。具体方法是：用胰酶将HEL细胞分散成单个细胞悬液，按1×10⁵/ml浓度分种于96孔板，24小时后换含不同浓度药物培养液，隔天换新鲜含药培养液，共3次。同时设不加药物的对照孔。12天后去掉培养液，加入含5 mg/ml MTT的无血清培养液，每孔100 μl，37℃，5%CO₂箱内置4小时后，弃上清，加入二甲亚砜(DMSO)，每孔100 μl，混匀，5～10分钟后，置96孔酶标测定仪上，测570 nm波长下的吸光度A值(曾称光密度OD)。找出细胞对药物的最大耐受浓度(MTC)。

2.流式细胞仪检测细胞CMV-IEA：将HEL细胞按1×10⁵/ml分种于内含飞片的24孔板，感染病毒2小时后，换含药培养液，同时设不加药物的病毒对照，24小时后，弃上清，用0.01 mol pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，0.25%胰酶消化3～5分钟后，弃消化液，加Hanks液，用吸管将细胞轻轻吹打下来，并移入离心管中，800～1 000 r/min，离心5分钟，弃上清，用PBS洗2次后，加入CMV-IEA单抗(1∶100)，37℃，30分钟，再用PBS洗2次后，加入荧光素标记的第二抗体(兔抗鼠IgG-FITC 1∶50)，37℃，孵育30分钟，PBS洗3次，置测定管，应用流式细胞仪(美国BD公司)测定荧光强度。

3.细胞培养及病毒感染：将HEL细胞按1×10⁵/ml分种于内含飞片的24孔板，待细胞成片后，按100倍半数组织培养感染量(TCID₅₀)/0.1 ml浓度接种CMV AD₁₆₉病毒，37℃，5%CO₂箱内吸附2小时，弃上清，用含2%小牛血清的培养液洗涤1次，再分别加入含MTC浓度不同药物的新鲜培养液，继续在上述条件下培养，隔天换液一次，同时设正常细胞对照组及病毒感染对照组。待病毒对照组细胞出现典型病变时，取出小飞片，PBS洗1次，风干，置4%多聚甲醛内，室温下固定30分钟后，常规乙醇逐级脱水，4℃保存；同时用0.25%胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800 r/min，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS洗2次，用70%冷乙醇固定，4℃保存。

4.凋亡细胞原位检测：用PBS(pH 7.4)将经4%多聚甲醛固定的细胞飞片洗5分钟，3次；再用含0.3%H₂O₂的甲醇浸泡，高温下30分钟，PBS洗3次后，浸入4℃预冷的含0.1% Triton X-100的0.1%枸橼酸钠液中2分钟；PBS洗2次，擦干标本周边。加入50 μl反应液即5 μl 10×末端脱氧核苷酸转移酶溶液及45 μl dNTP反应混合液(TUNEL反应液，用前现配)，盖上盖玻片，37℃湿盒内孵育1小时，PBS洗5分钟，3次，擦干标本周边，每片滴加50 μl抗体-过氧化物酶联结物，37℃湿盒内30分钟，PBS洗5分钟，3次；加入50 μl二胺基联苯胺(DAB)底物显色液，室温下显色10分钟，PBS洗5分钟，3次，常规脱水，透明后，封片镜检。显微镜下，胞核黄色着染者为阳性凋亡细胞。阳性对照：用DNaseⅠ(20 μg/ml)在室温下处理细胞片，以诱导DNA链的断裂。阴性对照：加入的TUNEL反应液中不含末端脱氧核苷酸转移酶。每张飞片至少观察500个细胞，计算凋亡发生率。

5.DNA含量的流式细胞仪测定：经70%冷乙醇固定的HEL单细胞悬液用pH 7.4的PBS洗，离心后去除固定液，加碘化丙锭(PI)染色液(含50 μg/ml PI，0.1% Triton X-100，100 μg/ml RNase A)混匀，4℃，避光30分钟后，应用流式细胞仪检测，低于G₁期DNA含量主峰(亚G₁期峰)的细胞为凋亡细胞。

6.bcl-2和fas基因mRNA表达：采用原位杂交技术参考文献［2，3］加以改进，将细胞飞片经4%多聚甲醛固定5分钟后，乙醇梯度脱水，37℃湿盒内预杂交2小时后，滴加杂交液(其中的探针预先经98℃变性后，立即置冰中5分钟，再加入到预杂交液中，探针终浓度为2 ng/μl)，42℃湿盒内杂交36小时，再加入地高辛-辣根过氧化物酶(1∶500)，37℃湿盒内1小时，然后按试剂盒说明进行显色，结果满意后，经PBS-焦磷酸二乙酯(DEPC)水洗终止，乙醇梯度脱水，二甲苯透明树胶封片镜检。设不加探针的阴性对照和RNase处理后的阴性对照。杂交结果进行计算机图像分析处理。

三、统计学处理

数据以均数±标准差(±s)表示，采用t或χ²检验进行比较分析，P＜0.05时，差别有显著意义。

结果

一、药物对细胞的毒性作用

将每种药物用维持液进行一系列稀释后，分别加入单层HEL细胞培养。结果当大蒜素浓度为7.5 μg/ml和更昔洛韦10 μg/ml时，细胞形态与对照正常细胞组相同，经MTT法检测，其A₅₇₀nm值与正常细胞对照组A值一致。当超过该浓度时，则出现细胞变圆，大小不一，皱缩等典型细胞毒性反应。由此确定上述各药物浓度为实<