【摘要】目的获得中国人相关位点的资料，确定中国人哮喘易感性与染色体5q31～33区域的连锁关系。方法采集32个哮喘家系共192份样品，并取39个正常无关个体为对照；用同位素掺入的聚合酶链反应(PCR)法扩增多态性遗传标记D5S436和D5S393，通过受累同胞配对法进行D5S436和D5S393与哮喘和高血清总IgE的连锁分析。结果正常对照分析：D5S436共获得9个等位片段，多态性信息含量（PIC）为0.803，杂合度（HET）为0.823，D5S393共有11个等位片段，PIC为0.892，HET为0.898，表明两个位点均属于高度多态性的遗传标记。连锁分析：D5S436与哮喘呈连锁状态（P＜0.05）,D5S393与哮喘没有连锁关系；D5S436和D5S393与高血清总IgE都没有显示连锁关系。结论染色体5q31～33区可能存在与中国人哮喘易感基因相关的1个或多个位点，是进行中国人哮喘易感基因研究的重要候选区域之一。

A preliminary study on linkage between genetic susceptibility to asthma and chromosome 5q31-33 region in Chinese populationZhao Hua^*, Du Xiaojuan, Lin Liyuan, et al. ^*Department of Biochemistry and Immunology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020

【Abstract】ObjectiveTo accumulate data on the asthma-related loci in Chinese population and determine whether genetic susceptibility to asthma was linked to the chromosome 5q31-33 region.MethodsOne hundred ninety-two samples from 32 families from Zhaoan county in Fujian province were collected. Specimens from 39 unrelated individuals were collected and used as normal controls. The polymorphic markers D5S436 and D5S393 were amplified by PCR incorporated with radioactive isotope. Linkage analysis was performed using the sib-pair method.ResultsNine alleles in D5S436 were obtained. The polymorphism information content (PIC) and heterozygosity of D5S436 was 0.803 and 0.823 respectively. There were 11 alleles in D5S393. The PIC and heterozygosity was 0.892 and 0.898, respectively. These data indicated that both were highly polymorphic markers and can be convincingly used in positional cloning. Significant evidence for linkage to asthma was observed with D5S436 （P＜0.05）but not with D5S393. No significant linkage of total serum IgE to D5S 436 or to D5S 393 could be identified.ConclusionThe preliminary results suggested that the region of chromosome 5q31-33 may contain one or more loci associated with the susceptibility to asthma in Chinese population. Therefore, it may still be a very attractive candidate region for further approach.

【Keywords】AsthmaPolymorphism (genetics)ChromosomesLinkage (genetics)

支气管哮喘具有遗传倾向，作为一个重要的多基因遗传病，已经成为国际上多基因遗传病研究的热点之一。近几年来在确定哮喘易感性的相关基因的研究中，通过进行全基因组DNA扫描和潜在候选基因确定两种技术手段，已经提出了几个可能的候选基因和染色体候选区域^［1～3］。其中染色体5q31～33区含有参与变态反应和哮喘炎症过程的大量调节因子基因群，是国际上最引人关注的染色体候选区域^［4，5］。本研究在全国90万儿童哮喘流行病学研究的基础上^［6］，在发病率最高（达5.6%）的福建省诏安县采集哮喘家系样本，选择染色体5q31～33区的两个多态性遗传标记进行实验分析，旨在获得中国人群样本在相关位点的资料，确定该区域与中国人哮喘易感性的连锁关系。

对象和方法

一、研究对象

1. 哮喘家系样本：于1996年4月和1997年1月先后两次在福建省诏安县人民医院医生的配合下，选取以哮喘患儿为先证者的核心家庭或三代家系为对象进行采样，所有受检个体在征得同意后，进行了几项测试：（1）根据国际间统一问卷诊断标准，了解患病情况及危险因素。（2）变应原皮肤点刺实验，共21种吸入性变应原。（3）肺功能测定，采用一秒用力呼气流量（FEV1.0）及峰流速测定。由于受当地条件限制，仅少数人做了组胺激发实验和肺功能测定。进行实验研究的哮喘家系共32个，血样192份，年龄分布范围在0.8～80岁之间。其中患者人数为101，患病百分率为52.3%；男性97人，患者人数为59，患病百分率为60.8%；女性95人，患者42人，占43.8%；男高于女，χ²=5.358, P＜0.05; 同胞配对数55个，患病同胞配对数为50个。

2. 正常对照组：在诏安地区采集19份血样，选自诏安县医院实习学生和医生。北京地区20份血样，取自我所实验室工作人员。所有对照均无哮喘史及典型过敏史，其中男性22人，女性17人，年龄分布在18～55岁之间。

二、实验方法

1. 主要试剂：聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增多态性遗传标记D5S436和D5S393的引物系根据文献^［7］，由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：

D5S436 CA引物5′TATGTGCCAGGCATTACGCT-3′

GT引物5′-GTCTCCACCCACAGCAGG-3′

D5S393 CA引物5′-TTGCTACCTGNCCTTTCCTCT-3′

GT引物5′-CATTCCTCATTCCTCATTCC-3′

Taq DNA聚合酶购自上海生物工程公司；Taq track sequencing system试剂盒、dNTP、蛋白酶K为Promega公司产品；［α-³²P］dATP购自亚辉公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自中国协和医科大学科技开发公司。

2. 血清总IgE水平的测定：采用双抗体夹心酶联免疫法，实验步骤参考试剂盒说明书进行。每次实验均作IgE工作标准曲线；每个样品均平行加入两个孔中，若两孔吸光度(A)值读数变异大于10%，则进行重复实验。鉴于不同人群的遗传背景及生活环境的差异，将诏安地区哮喘家系样本血清总IgE的均值定为正常值上限。

3. 多态性遗传标记的PCR：哮喘家系样品在当地置于4℃冰箱中，于72小时内低温运回北京，立即进行全血基因组DNA的提取。DNA的提取参考文献［8］，按照本实验室常规方法进行。简言之，用无菌双蒸水低渗溶解红细胞，以100 μg/ml蛋白酶K消化液悬浮白细胞，37℃消化过夜后，进行饱和酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，即可获得基因组DNA。D5S436和D5S393的PCR扩增采用同位素掺入法，在冰浴中配制PCR反应混合液，在12.5 μl反应体积中含DNA模板50ng, 引物0.1 μmol/L, MgCl₂ 1.5 mmol/L, dGTP、dCTP和dTTP各0.2 mmol/L, dATP 0.05 mmol/L, 并加入［α-³²P］dATP（370 MBq/ml）1 μl/100 μl反应体积，Taq DNA聚合酶0.625 U。待PCR仪预热至94℃，将混合液放在PCR仪上，变性3分钟后，开始循环。循环条件为：94℃、40秒，60℃、40秒，72℃、1分钟，共35个循环，最后延伸为72℃、10分钟。反应结束后加入含95%甲酰胺的终止液。

4. PCR产物的电泳分析及片段大小的判读：用含7 mol/L尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，样品经100℃变性5分钟后上样，恒功率60W, 电泳时间4～6小时，按常规方法固定干胶后，进行放射自显影。每块胶可进行两批样品上样，两次上样时间间隔30分钟；同一家庭成员的样品尽量在一起上样。正常人D5S436和D5S393的PCR扩增片段大小是参照已知的M13和pUC18的DNA序列分析结果获得的。用Taq track sequencing system通过双脱氧末端终止法对M13和pUC18进行序列分析，将测序反应产物与PCR产物同时进行电泳，既可精确判读出PCR扩增片段的大小。从已知的正常无关个体中选出3个个体，其多态性遗传标记等位片段大小分别位于不同的片段长度范围，且能完全分开，以此为对照，与哮喘家系样品同时上样进行电泳分离，判定哮喘家系样品的PCR扩增片段长度。

三、统计学分析

根据正常对照组的资料，计算多态性遗传标记的多态性信息含量（polymorphism information content, PIC）和杂合度（heterozygosity, HET）。

用世代一致性（identical by decent, IBD）和状态一致性（identical by state, IBS）通过受累同胞配对法，采用PPAP软件（哈尔滨医科大学流行病教研室研制）分别将同胞对的D5S436和D5S393的等位片段结果，以一一对应的关系输入计算机，与哮喘和高血清总IgE进行连锁分析。

结果

一、血清总IgE水平

诏安地区哮喘家系样本血清总IgE水平为273±194 kIU/L（±s），其中成人为293±194 kIU/L，略高于儿童的水平（245±191 kIU/L）；哮喘患者的血清总IgE平均值无明显增高。以300 kIU/L定为诏安地区哮喘家系样本血清总IgE的正常值上限。

二、多态性遗传标记的分析结果

同位素掺入的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，读出每个个体的等位片段长度，按照从大到小顺序依