【摘要】目的探讨围产期缺血缺氧脑损伤后即刻早期基因（c-jun）的表达变化规律及其与神经元凋亡的关系。方法通过结扎Wistar孕鼠一侧子宫角血管（其宫内胎鼠作为对照），建立围产期缺血缺氧脑损伤动物模型。采用原位杂交及原位末端标记法观察剖宫产后存活不同时间大鼠大脑c-jun mRNA的表达及神经元凋亡的情况。结果缺血后15分钟，大脑皮层和海马CA3区即出现c-jun mRNA的表达，随时间延长，表达量逐渐增加，至1～2小时，杂交信号最强，4小时后逐渐减弱，但到24小时，c-jun mRNA表达又出现第二次高峰，以后逐渐减弱，至3天基本消失；对照组仅在生后24小时海马有较少量的表达。并发现缺血后2天神经细胞凋亡数明显多于对照组。结论宫内缺血缺氧可使c-jun的表达增强和凋亡细胞增加，c-jun的改变可能引起了其后续与细胞凋亡相关基因的转录，从而导致细胞凋亡的发生。

The relationship between the expression of c-jun mRNA and neurons apoptosis following perinatal ischemic-hypoxiaMu Dezhi, Zhang Guorong, Liang Weilan， et al. Department of Pediatrics, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between c-jun mRNA and neurons apoptosis following perinatal ischemic-hypoxia.MethodsThe authors set up a fetal rat model of perinatal ischemic-hypoxia by ligating unilateral uterine horn vessel of pregnant Wistar rats . The contralateral horn vessel was not ligated and those fetuses served as controls. Rat pups were delivered by cesarean section at the end of ischemic- hypoxic insult and then the rats' brain tissues were collected at different time. In situ hybridization and in situ end labeling methods were used to detect c-jun mRNA and neurons apoptosis separately.ResultsThe results showed that the expression of c-jun mRNA began at 15 minutes, peaked at 1-2 hours after ischemic-hypoxic insult and reduced gradually by 4 hours. The expression of c-jun mRNA reached another peak at 24 hours after the insult and then disappeared gradually till 72 hours. Only a slight hybrid signals could be found at the time of one day in hippocampus in the control group. Meanwhile, the number of cells with apoptosis at two days after ischemic-hypoxia was much more than that in the control group.ConclusionThese results indicated that the increase in expression of immediate early gene c-jun and then the cell apoptosis could be induced by perinatal ischemic-hypoxia. The expression of c-jun mRNA might induce the transcription of its target gene, especially, some “genes promoting apoptosis”.

【Keywords】Cerebral ischemiaCerebral anoxiaPerinatologyGenes, junApoptosis

脑缺血缺氧所致的病理损害是由一个复杂的综合因素引起，既有神经元的急性水肿、坏死又存在神经元迟发性死亡的改变^［1，2］。但引起这些病理改变尤其是神经元迟发性死亡的原因尚不完全清楚。即刻早期基因(c-jun)可作为一种转录因子调节细胞内相应靶基因的表达，在对其后续靶基因的转录调节时，可能会触发死亡基因的转录，也可能是其自身介导了程序化的细胞死亡。c-jun是一种重要的即刻早期基因，已有研究认为它在神经元凋亡中起着重要作用^［3］。近年来国外在体外培养的神经元及成年鼠脑缺血时，对c-jun mRNA的表达做过一些研究，但尚未见在围产期缺血缺氧后胎鼠从出生到成年整个发育过程中c-jun mRNA表达变化规律及其与神经元凋亡关系的研究。因此，我们将研究的结果作一报道。

材料与方法

一、材料

孕龄21天的Wistar大鼠及代乳鼠，由北京医科大学实验动物中心提供，c-jun的cDNA探针由中科院基础所提供，地高辛DNA标记和检测试剂盒由Boehringer Mannheim公司提供（德国)。细胞凋亡检测试剂盒购于华美生物工程公司。

二、方法

1.缺血缺氧动物模型的制备：参阅文献［4，5］的方法。用3％ 氟烷将孕鼠麻醉后，剖腹并结扎一侧怀孕子宫角的血管（卵巢及宫颈两端均结扎）共10分钟，作为缺血缺氧模型胎鼠，另一侧子宫角的血管不结扎，其宫内胎鼠作为对照。缺血缺氧10分钟后，立即行剖宫产，取出胎鼠，注意保暖，待其复苏。

2.脑组织标本的留取：模型制作后分别留取从产出即刻、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、1周、2周、3周、4周、成年（2个月）各时间点的脑组织标本，缺血及对照各6份。

3.原位杂交及末端标记脑片的制备：72小时以内的组织，按既定的各时间点，迅速断头后立即取出脑组织于4％的多聚甲醛中固定12～24小时，然后再置于20％的蔗糖溶液中24～48小时（4℃）。大于1周龄的动物则先麻醉后，经主动脉灌注固定液，再取出脑组织后固定，方法同前。组织经蔗糖充分置换后，于液氮冷却的正己烷中速冻，并作连续冰冻切片（10 μm厚），保存于-70℃冰箱，用于原位杂交及末端标记。

4.原位杂交：c-jun cDNA探针的标记，每次取其cDNA 1 μg, 标记均按试剂盒要求程序进行。杂交前各组织片经梯度乙醇处理，磷酸缓冲盐液（PBS）洗涤2分钟后，用0.2 mol /L 盐酸于室温处理10分钟，PBS洗涤5分钟×2次。经0.25％乙酸酐和0.1 mol/L三乙醇胺平衡电荷后，用含乙酸胺的梯度乙醇脱水。晾干后每片滴加杂交液10～15 μl，用封口膜覆盖后，在湿盒内，42℃，反应24小时。系列标准柠檬酸盐-氯化钠（SSC）洗涤。阻断反应后，加入抗地高辛的抗体，于37℃保温1小时，用检测缓冲液洗涤并平衡后，在碱性磷酸酶显色体系中，室温显色，光镜下观察原位杂交阳性信号，以深蓝色沉淀为杂交阳性信号。

5.原位末端标记：细胞发生凋亡时，DNA链在核酸内切酶的作用下断裂出现缺口，即产生一系列DNA3′-OH末端，此时，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将生物素标记的dUTP连接到DNA的3′-OH末端，即可进行凋亡细胞的监测。此类方法称为原位末端标记。其操作过程为：组织片加蛋白酶K（20 μg/ml），每片50 μl，室温 放置15分钟，用PBS洗涤3分×3次；然后用0.3％过氧化氢室温处理20分钟，PBS洗涤3分钟×2次。再用标记缓冲液将末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)和生物素标记的dUTP混匀后加于组织片上，湿盒中，37℃，标记1小时。以封闭液将链亲和素-辣根过氧化物酶按1/50稀释后，每片加50 μl，湿盒中，37℃，反应30分钟。在3.3-二氨基苯联胺（DAB）显色体系中显色，黄色着色为阳性反应细胞。

结果

一、缺血缺氧胎鼠一般情况

当结扎子宫血管2～3分钟时，可见胎鼠出现胎动增加，到5～6分钟，胎动增强最明显，7～8分钟后胎动逐渐减弱至停止。缺血10分钟剖宫取出的模型鼠基本上都有皮肤青紫，个别出现苍白甚至死亡。一般在保暖情况下复苏20分钟，肤色即转红润。生后肤色苍白、自然复苏20分钟仍不能自主呼吸者，将不被纳入实验。所有剖宫产胎鼠，将由自然生产后1天的Wistar 哺乳鼠哺乳。

二、脑片原位杂交结果

对照组：从出生到成年各时间点的脑片中，仅在生后24小时，海马部位出现较弱的杂交信号（图1）。其他各时间点及部位均未发现c-jun mRNA的表达。

缺血缺氧实验组：缺血后15分钟，海马CA3区及大脑皮层即开始出现c-jun mRNA的阳性杂交信号（图2）；30分钟，可见阳性杂交信号逐渐增多，整个海马区可见其mRNA的表达（图3）；生后1～2小时可见海马及皮层的阳性杂交信号明显增强（图4），达一峰值；4小时后杂交信号逐渐减弱，8小时减弱已较明显；但至生后24小时，又发现其阳性杂交信号明显增强，c-jun mRNA的表达又达一峰值（图5），放大倍率后，可见典型的mRNA表达（图6）；其后，杂交信号随时间延长而明显减弱，至3天时基本消失，但个别脑组织在1周时CA3区仍有少量表达；2周至成年各组未能检出c-jun mRNA的阳性杂交信号。

三、原位末端标记检测结果

缺血缺氧后48小时，可见细胞核DNA断裂，在显微镜下记录并比较单位视野里阳性细胞数（每张组织片计算10个视野的阳性细胞，通过换算得出每个视野中阳性细胞数的均值），发现经末端标记着色呈阳性反应的神经细胞明显增多（图7），而对照组相应时间点的阳性细胞数却明显少于缺血缺氧组（图8）。

讨论

一、缺氧模型的建立

本研究制作的缺血缺氧动物模型是根据文献［4，5］的方法进行的，缺血后脑组织经病理切片观察提示有神经元及间质的水肿及神经元的变性、坏死、结构紊乱等，符合缺血缺氧的病理改变，故可认为模型制作是成功的。

二、c-jun 表达与脑缺血缺氧

脑内神经细胞的信息传递经跨膜传导机制，激活细胞内第二信使系统，在引起细胞瞬时反应的同