设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
Effect of cytomegalovirus infection on apoptosis and expressions of bcl-2 and fas mRNALi Hong, Dong Yongsui, Fang Feng, et al. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between cytomegalovirus (CMV) infection and the frequency of apoptosis.MethodsThe authors detected the human embryonic lung (HEL) fibroblast cells infected with CMV in vitro and hepatic tissues of CMV hepatitis with in situ end-labeling (TUNEL) apoptotic cell detection method and flow cytometric cell cycle analysis, and also investigated the expressions of bcl-2 and fas mRNA by means of in situ hybridization techniques and image analysis system.ResultsCMV infection enhanced apoptosis significantly in vitro and in vivo (both P＜0.01). Meanwhile, higher expression of fas-mRNA and lower expression of bcl-2 mRNA were found in hepatic tissues of CMV hepatitis patients and CMV-infected HEL cells than that in the normal control.ConclusionThese studies demonstrate that abnormal expressions of bcl-2 and fas mRNA may be involved in the pathological mechanisms of diseases assosiated with CMV-infection.
【Keywords】Cytomegalovirus infectionsApoptosisGenes, bcl-2Gene expression
细胞凋亡是单个细胞受其内在基因编程调节，通过主动的生化过程，而自杀死亡的现象［1］。凋亡规律失常已被认为是许多疾病的重要发病机制。近年研究发现，许多病毒性疾病（如病毒性肝炎，艾滋病等）的发生与细胞凋亡有关［2］。巨细胞病毒（CMV）感染极为普遍，它常可致先天性畸形、中枢神经系统损害、小儿肝炎、肺炎、视网膜病等各种疾病［3］。然而，目前有关CMV感染是否也存在着凋亡规律的异常，国内外研究甚少。作者通过检测体内CMV感染所致CMV性肝炎患儿的肝组织及体外CMV AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HEL)内凋亡发生情况，以及CMV感染对凋亡调控基因B cell lymphoma-leukemia-2(bcl-2)和fas 表达的影响，探讨CMV感染与细胞凋亡的相互关系。
材料和方法
一、材料
1.细胞：自制HEL，取自妊娠4个月水囊引产的胚胎，经常规原代细胞培养方法，制成单层细胞，第10～20代用于本实验。
2.病毒：CMV AD169病毒株，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。
3.标本来源：1994年8月～1995年8月，同济医院儿科感染病房收治的临床诊断为婴儿黄疸型CMV肝炎患儿的肝组织标本（包括活检及尸检标本），共7例，其血清抗CMV-IgM、IgG经酶联免疫吸附(ELISA)方法检测（Human公司试剂盒）均为阳性，并排除甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等感染。另选3例成人胆结石术中所取正常肝组织标本为对照，亦排除HAV、HBV、HCV等感染。上述肝组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋处理。作5μm厚连续切片备用。
4.试剂：抗巨细胞病毒即刻早期抗原（CMV-IEA）单抗由美国UAB儿童医院Britt教授提供（1:100）。过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)免疫染色试剂由同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室提供。地高辛标记与检测试剂盒以及细胞凋亡原位检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。含bcl-2 cDNA及fas-cDNA片段的质粒由同济医科大学免疫教研室惠赠。bcl-2 cDNA片段长度为2.0 kb，于EcoR I 单酶切位点插入载体Bluescript质粒中，经氯化钙渗透法转化入JM101菌株； fas-cDNA 片段长度为2.3 kb，于BamHI及XBaI酶切位点插入载体pUC18，经氯化钙渗透法转化TG1菌株，再按常规方法提取质粒DNA，经酶切，回收，纯化后，获得bcl-2及fas cDNA探针。
二、方法
1.细胞培养及病毒感染：将HEL细胞按1×105/ml分种于内含飞片的24孔板，待细胞成片后，按100半数组织培养感染量(TCID50)/0.1ml浓度接种CMV AD169病毒，37℃,5% CO2箱内吸附2小时，弃上清，用含2%小牛血清的培养液洗涤1次，换新鲜培养液，继续在上述条件下培养，隔3天换液一次，同时设正常细胞对照组。待细胞出现典型病变时，取出小飞片，磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗1次，风干，置4%多聚甲醛内，室温下固定30分钟后，4℃保存；同时用0.25%胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800 r/min，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS洗2次，用70% 冷乙醇固定，4℃保存。
2. 肝组织抗CMV-IEA检测：采用PAP法［4］，检测肝组织内CMV-IEA表达情况。显微镜下，细胞核为棕黄色者，即为CMV-IEA阳性细胞。同时检测CMV感染的人胚肺细胞飞片，设为阳性对照；阴性对照用PBS代替特异性第一抗体。
3.凋亡细胞原位检测： 石蜡切片脱蜡，逐级水化，蛋白酶K（20μg/ml）37℃消化20分钟。PBS（pH值7.4）将组织切片和细胞飞片洗5分钟，3次；滴加 50μl反应液（5μl 10×末端脱氧核苷酸转移酶溶液及45 μl dNTP反应混合液，用前现配），37℃孵育1小时，PBS洗5分钟，3次，滴加50μl抗体-过氧化物酶联结物，37℃30分钟，PBS洗5分钟，3次；加入50μl DAB底物显色液，室温10分钟，PBS洗5分钟，3次，常规脱水透明，封片镜检。显微镜下，胞核黄色着染者为阳性凋亡细胞。阳性对照：用DNase I（20 μg/ml）在室温下处理组织片和细胞片，以诱导DNA链的断裂。阴性对照：加入的TUNEL反应液中不含末端脱氧核苷酸转移酶。每张切片至少观察500个细胞，计算凋亡发生率。
4.DNA含量的流式细胞仪测定：取出经70%冷乙醇固定的HEL单细胞悬液，PBS(pH值7.4)洗，离心后去除固定液，加碘化丙锭（PI）染色液（含50 μg/ml PI，0.1%Triton X-100，100 μg/ml RNase A），混匀，4℃，避光30分钟后，应用流式细胞仪FACStar（美国BD公司）检测，低于G1期DNA含量主峰（亚G1期峰）的细胞为凋亡细胞。
5.原位杂交：bcl-2和fas基因mRNA原位杂交检测参考文献［5，6］加以改进，石蜡切片脱蜡至水，蛋白酶K（100 μg/ml）消化20分钟；4%多聚甲醛固定5分钟后，乙醇逐级脱水，37℃湿盒内预杂交2小时，滴加杂交液（其中的探针预先经98℃变性后，立即置冰中5分钟，再加入到预杂交液中，探针终浓度为2 ng/μl），42℃湿盒中杂交36小时。再加入Dig-辣根过氧化物酶（1:500），37℃湿盒内1小时，之后按试剂盒说明进行显色，结果满意后，PBS-DEPC水洗终止，乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片镜检，设不加探针的阴性对照和RNase处理后的阴性对照。杂交结果进行计算机图像分析处理。
三、统计学处理
数据以均数±标准差（±s）表示，采用t或χ2检验进行比较分析，P＜0.05时，差别有显著意义。
结果
一、肝组织抗CMV-IEA检测结果
7例CMV性肝炎患儿的肝组织内均可见到细胞核呈黄色着染的肝细胞（图1a），提示为CMV感染的肝组织，这与标本选择时，血清抗CMV检测结果一致；而3例正常对照的肝组织经PAP法检测未见阳性细胞，证实为非CMV感染（图1b）。
二、体内外CMV感染对细胞凋亡发生的影响
1.CMV感染的肝细胞凋亡情况：在肝组织切片中，7例CMV感染者的肝组织内肝细胞凋亡发生率为53.7%（图2a）；而3例非CMV感染者的肝细胞凋亡发生率为7.2%（图2b），经χ2检验，P＜0.01，差异有显著性意义。
2.CMV感染的HEL细胞凋亡情况：(1)经凋亡细胞原位检测结果显示：正常HEL细胞呈梭形排列，其中可见阳性凋亡细胞单个散在分布，阳性率为3.7%（图3a）；而病毒感染对照组中，受CMV感染的HEL细胞变大变圆,阳性细胞多为发生病变的病毒感染细胞，阳性率为34.4%（图3b），经χ2检验，P＜0.01，差异有显著性意义；(2)经流式细胞仪测定结果显示：正常细胞组在DNA直方图上表现为G0/G1、S、G2、M期（图4）；而病毒感染组则在G1峰左侧有一亚二倍体细胞群的峰型（亚G1峰），提示发生细胞凋亡（图4）。
