【摘要】目的探讨尿中Ⅳ型胶原在肾小球疾病诊断中的应用价值。方法应用竞争抑制性酶联免疫吸附实验，检测了20例健康人及38例肾小球疾病患者尿中Ⅳ型胶原的水平，并与肾活检的组织病理进行了比较。结果病理改变较为严重的患者以及肾活检为系膜增生性肾小球肾炎并伴有局灶性硬化、粘连和(或)新月体形成的患者，尿中Ⅳ型胶原的含量明显高于正常对照；但肾活检仅显示系膜增生性肾小球肾炎的患者，尿中Ⅳ型胶原水平同正常对照。结论尿中Ⅳ型胶原水平的测定，可以作为一个无创性的临床检测指标，有助于肾小球疾病的病理变化及其程度的诊断。

Detection and significance of urinary type Ⅳ collagen in glomerular diseasesMa Jie, Ding Jie, Yang Jiyun. Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034

【Abstract】ObjectiveTo explore the value of detecting urinary type Ⅳ collagen in diagnosis of glomerular diseases.MethodsUrinary type Ⅳ collagen was measured by using the competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in 20 healthy controls and 38 patients with glomerular diseases, and the results were compared with pathologic changes revealed by renal biopsies.ResultsUrinary type Ⅳ collagen increased significantly in patients with severe pathologic changes in glomeruli as well as patients with mesangial proliferative glomerulonephritis which accompanied by focal glomerulosclerosis, synechiae and (or) cresents, while the urinary type Ⅳ collagen in patients with mesangial proliferative glomerulonephritis was at the same level as normal controls.ConclusionThe measurement of urinary type Ⅳ collagen, as a noninvasive clinical marker, is useful in diagnosis and understanding pathologic changes and severity of glomerular diseases.

【Keywords】CollagenExtracellular matrixGlomerul onephritis, membranoproliferative

有研究表明尿中Ⅳ型胶原含量的变化，反映了肾小球基底膜的代谢和肾小球滤过屏障的改变^［1］。因而，测定尿中Ⅳ型胶原的水平，有可能成为一个无创性的间接反映肾脏疾病病理改变的指标。本研究建立了竞争抑制性酶联免疫吸附实验，检测了经肾活检诊断为不同病理类型的肾小球疾病患者，特别是儿童常见的系膜增生性肾小球肾炎患者尿中Ⅳ型胶原的水平，并结合肾脏病理改变进行分析，以评价其临床应用价值。

对象和方法

一、研究对象

本实验的研究对象共分为如下四组：

组Ⅰ：选取无肾脏病和其他系统疾病病史及临床症状者作为本研究的正常对照，其中儿童15例，年龄8～14岁。成人5例，年龄28～65岁，男、女各10例。

组Ⅱ：经肾活检病理或典型临床表现确诊为膜性肾病、膜增殖性肾小球肾炎、糖尿病肾病、急进性肾小球肾炎者，共14例，其中儿童5例，年龄10～14岁，男4例，女1例；成人9例，年龄30～62岁，男7例，女2例。这组患者临床表现除有血尿和(或)蛋白尿外，其中8例患者血肌酐和血尿素氮水平升高，7例同时伴有血压升高。由于以往文献报道上述类型肾炎患者尿中Ⅳ型胶原的水平均升高，因而我们将这类患者作为本研究的阳性对照组。

组Ⅲ：选取肾活检病理确诊为系膜增生性肾小球肾炎者，共16例，男10例，女6例，年龄8～14岁。其中多数患者肾活检光镜可见约10个肾小球，1例可见5个肾小球。光镜下观察大部分肾小球表现为系膜细胞稍增多，约为3个/系膜区，肾小球系膜基质轻度弥漫性增生。增生的系膜组织对肾小球毛细血管袢无明显影响，系膜宽度未超过毛细血管直径。16例患者中诊断IgA肾病8例，紫癜性肾炎2例，狼疮性肾炎2例，原发性肾病综合征4例。此组患者临床表现多为血尿及蛋白尿。5/16例尿蛋白达(+++)，这组患者肾功能检查及血压均正常。

组Ⅳ：选取肾活检病理确诊为系膜增生性肾小球肾炎并伴有局灶性硬化、粘连和(或)新月体形成的患者，共9例，男6例，女3例，年龄7～13岁。9例患者，肾活检光镜可见约11个肾小球，1例可见20个肾小球。该组患者的肾组织光镜下可见大部分肾小球系膜细胞和系膜基质轻度弥漫性增生，增生的系膜组织对肾小球毛细血管袢无明显影响，系膜宽度未超过毛细血管直径。并且部分肾小球表现为硬化、粘连和(或)新月体形成。这部分肾小球约占肾组织切片所见整个肾小球的30%。9例患者中诊断紫癜性肾炎3例，狼疮性肾炎2例，原发性肾病综合征4例，此组患者临床表现为血尿和(或)蛋白尿，其中2例尿蛋白达(+++)，肾功能检查及血压均正常。

二、实验方法

1.标本收集：晨尿标本离心后，将尿上清液分装并储存于-70℃，本实验所测标本的冻融次数≤3次。

2.竞争抑制性酶联免疫吸附实验：为克服直接用待检尿包被ELISA板时，尿中其它蛋白或抗原成分非特异的结合而减少了尿中含量相对较少的Ⅳ型胶原在ELISA板上的结合，使实验敏感性下降的缺点，我们参照Donovan的酶联免疫吸附实验^［1］，并作适当修正。方法如下：标准曲线各点及待检的尿标本均采用双管测定。首先在试管中加入等量的抗Ⅳ型胶原抗体(1∶50)，再加入如下三类抗原配制的三种抗原-抗体溶液，进行预孵育(4℃过夜)。即(1)倍比稀释的标准Ⅳ型胶原抗原(从小鼠EHS肿瘤提取)；(2)以0.01 MPBS代替抗原；(3)待检尿标本。在ELISA板上用等量的Ⅳ型胶原(800 ng/100 μl)包被，再分别加入以上三种抗原-抗体溶液，室温孵育2小时。因而，预孵育时在试管中尚未与抗原结合的抗体(抗体活性未被抑制)，将与ELISA板上包被的抗原结合。而后再相继加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠的IgG抗体及底物(对氨基-硝基-苯基-磷酸盐，PNPP)，于波长410 nm比色。各次试验均以倍比稀释的标准Ⅳ型胶原配制的抗原-抗体溶液的测得值作标准曲线。预孵育时以PBS代替抗原的试管所读取的吸光度A(曾称光密度OD)值，为抗Ⅳ型胶原抗体最大结合值(MaxA)。待检尿标本中Ⅳ型胶原含量根据标准曲线推算，并将测得的A值以结合率表示：结合率(%)=测得的A值/MaxA×100%，最后以该份尿标本Ⅳ型胶原测得值(ng/100 μl)与同份尿标本肌酐测得值(μg/100 μl)来表示尿中Ⅳ型胶原的含量(ng/μg)，以除外随机留取尿标本时尿量差异带来的检测误差。

三、统计学处理

数据用每组均数±标准差表示(±s)。采取SPSS/PC统计软件进行多组间方差分析、两组间q检验及相关性检验。

结果

正常人尿中即可测到Ⅳ型胶原，根据本试验采用的方法，本研究中正常对照组尿中Ⅳ型胶原平均水平为3.8±0.8 ng/μg。膜性肾病、膜增殖性肾小球肾炎、糖尿病肾病和急进性肾小球肾炎患者尿中Ⅳ型胶原水平为10.2±2.1 ng/μg，较正常对照组显著增多(P＜0.05)，为正常对照组的3～4倍，这一结果与以往文献报道相同。组Ⅲ患者即肾活检主要表现为系膜增生性肾小球肾炎，尿中Ⅳ型胶原水平为3.9±0.82 ng/μg，与正常对照组相比差异无显著意义(P＞0.05)；组Ⅳ患者即肾活检也主要表现为系膜增生性肾小球肾炎，但同时部分肾小球(约30%)表现硬化、粘连和(或)新月体形成，这类患者尿中Ⅳ型胶原的水平为7.1±2.1 ng/μg，高于正常对照组(P＜0.05)，为正常对照组的2～3倍。

组Ⅰ～组Ⅳ中各观察对象尿Ⅳ型胶原的含量如附图，可见尿中Ⅳ型胶原含量在各组观察对象间分布较集中，几乎没有重叠。以上各组数据均采用多组间方差分析，F值为79.68，P＜0.05。

考虑到尿中Ⅳ型胶原排出是否受常规方法所测尿蛋白排出量的影响，或者Ⅳ型胶原蛋白的排出是否为常规方法测得尿蛋白中的一分子，我们将患者尿中Ⅳ型胶原含量与尿蛋白的含量进行了相关性分析，结果二者无相关性(P＞0.05)。此外，本研究未提示尿中Ⅳ型胶原的测定受血尿、血尿素氮、血肌酐等因素的影响。

讨论

系膜增生性肾小球肾炎是儿科最常见的病理类型之一，系膜增生性肾小球肾炎主要表现为系膜细胞增生和系膜基质增多。许多作者及本研究室均证明^［2，3］，系膜增生性肾小球肾炎增生扩张的系膜基质中，含有Ⅳ型胶原、纤维粘连蛋白、板层蛋白等细胞外基质成分，并随着病变进展，Ⅳ型胶原等各基质成分的含量明显增加。细胞外基质成分进行性积聚是肾小球硬化的特点，那么这种基质进行性的变化，除了通过肾活检病理检查得以证实，能否通过无创性的检查间接提示这种病理变化的存在呢?本实验结果及国外文献报道均表明，具有明显细胞外基质变化的肾小球疾病，如膜性肾病、膜增殖性肾小球肾炎、糖尿病肾病和急进性肾小球肾炎患者，尿中Ⅳ型胶原水平明显增加。同时本研究还进一步检测了系膜增生性肾小球肾炎患者尿中Ⅳ型胶原水平的变化，结果表明：系膜增生性肾小球肾炎患者若肾组织中某些肾小球(本研究提示约30%的肾小球)表现为硬化、粘连和(或)新月体形成，尿中Ⅳ型胶原水平也会明显增高，为正常对照组的2～3倍。因此许多肾小球疾病时肾脏损伤表现出的细胞外基质变化<