人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)常引起免疫受抑制和免疫缺陷病人的严重感染，如果能早期诊断活动性HCMV感染并给予抗病毒药治疗可有效地减轻临床症状、降低死亡率。本文综述了HCMV感染的特点及HCMV-mRNA检测技术在诊断活动性HCMV感染时的意义，同时与其它常用的HCMV检测技术进行比较。

(一)HCMV感染的特点

人类巨细胞病毒在人群中的感染相当普遍，血清流行病学检查已证实HCMV感染存在于各种人群中，人群抗HCMV血清抗体阳性率随年龄增加而升高，尤其在某些发展中国家，抗HCMV血清抗体阳性率高达100%，如我国武汉和成都地区6～12岁儿童中抗HCMV血清抗体阳性率已达83.8%和75.2%。

HCMV感染的一个显著特点是常引起潜伏感染。正常人原发感染该病毒后常无临床表现。但在原发感染之后，病毒不会被机体清除掉而是以一种慢性感染或潜伏感染的形式存在。病毒可潜伏于血管内皮细胞、巨噬细胞和巨噬细胞前体中，当机体免疫力受抑制时，引起感染复发或反复排毒。在免疫受抑制和免疫缺陷病人中，HCMV感染可引起活动性感染，即病毒在体内多脏器大量复制并播散，引起多种临床疾病，如肺炎(最常见)、肝炎、脉络视网膜炎、胃肠道疾病或白细胞减少性发热，常引起病人死亡，如骨髓移植的病人移植后HCMV感染率为60%～70%，且有10%～50%发展成间质性肺炎，其中大约60%～80%死亡。

如能早期诊断活动性HCMV感染，并及时给予抗病毒治疗可有效改善免疫受抑制和免疫缺陷病人活动性HCMV感染的症状，降低其疾病的严重性和死亡率。因此，在监测HCMV易感病人时，应及早而准确地把握病人是否发生活动性HCMV感染，这样才能及时治疗活动性感染的病人，又使未发生活动性感染的病人免受抗病毒药的毒性损害。

(二)HCMV-mRNA检测技术

由于在HCMV的潜伏性感染时，病毒复制的水平低，仅有少量的细胞转录HCMV-mRNA。而当活动性HCMV感染时，病毒在细胞中的复制会明显地增多，表达HCMV-mRNA的细胞也会随之增多。因此，检测病毒mRNA是快速诊断HCMV活动性感染的一项黄金指标，对于诊断活动性感染可早于其它传统检测HCMV的技术^［1］。

HCMV的自我复制周期分三个阶段，第一阶段称为即刻-早期阶段(immediate-early phage,IE)，这个阶段开始于病毒进入机体细胞后，为即刻-早期基因的转录，相应的IE-RNA的表达及IE蛋白的合成。其作用是对其后的病毒基因表达进行有效的调控。目前主要的用于检测的IE-mRNA是1.95 kb的主要即刻-早期mRNA(MIE-mRNA)，它是HCMV基因组的IE1编码区域的转录产物，翻译产物为HCMV最主要的IE蛋白质，分子量为72 kU。这种磷蛋白在机体感染HCMV仅1小时后，即可在机体细胞核中检测到，它是影响病毒和细胞转录的调节蛋白。第二阶段称为早期阶段(early phage, E)，是DNA复制前的阶段，合成DNA多聚酶及其它蛋白，有关这一阶段的mRNA检测少有报道。第三阶段称为晚期阶段(late phage, L)，其特点是病毒结构蛋白的合成，病毒体的组装和新病毒的释放。其中翻译结构磷蛋白pp150的mRNA是HCMV的一种最主要的晚期mRNA(L-mRNA)，其合成的pp150是病毒最重要的一种蛋白。此外，HCMV的开放阅读区域UL 83编码分子量为64 kU～68 kU的磷蛋白pp65，它是病毒体和致密颗粒的主要组成部分，占病毒体所有蛋白的15%^［2］和致密颗粒所有蛋白的95%^［3］。因此，pp 65 mRNA是另一种比较重要的L-mRNA，在活动性HCMV感染的早期，即可从外周血单核细胞、多核细胞和内皮细胞中检测到。由于HCMV-mRNA检测技术具有较高的敏感性，在外周血白细胞处于低水平HCMV-pp65 mRNA转录的时期即可诊断活动性HCMV感染^［4］。

在众多的HCMV-mRNA中，HCMV的IE-mRNA是最特异性的表明病毒活动性感染的指标，外周血单核细胞是主要的表达HCMV的IE-mRNA的细胞，外周血表达HCMV的IE-mRNA的细胞数量与HCMV感染的严重性成正相关^［5］。

目前检测HCMV-mRNA的方法主要有原位杂交和逆转录-聚合酶链反应技术(reverse transcriptase-PCR,RT-PCR)两种。这两种检测技术各有其特点，也有人将它们结合起来进行诊断。一般而言，原位杂交技术具有形态学定位良好、探针稳定性高和操作简便的优点，但其敏感性比RT-PCR低^［6］。

原位杂交技术要求杂交的病毒mRNA必须具有特异性和代表性。有人认为RNA探针比DNA探针更适合于原位杂交检测HCMV，前者具有更高的敏感性且体外易合成^［6］。放射性同位素(如：³⁵S^［7］)和非放射性物质(如：地高辛-抗地高辛-碱性磷酸酶^［6］)都可用于标记探针，后者比前者具有更高的敏感性^［6］。根据欲检测的HCMV-mRNA相关基因设计反义RNA探针(antisense RNA probe)。根据HCMV-pp65基因开放阅读框架(UL83)的碱基排列顺序，设计探针序列为：启动子5′-GCGGGATCCATGGAGTCG CGCGGTCGCCG-3′和5′-GCGGGATCCAC CTCGGTGCTTTTTGGGCG-3′^［7］，将它插入到质粒的强启动子下游的多克隆位点处，组建重组质粒，再将其导入大肠杆菌DH5_α中，以其为模板进行扩增，产生的克隆(pPCR 65E1)用限制性内切酶使其线性化，并在提供放射性同位素或非放射性物质标记的寡核苷酸的情况下，用T7和T3 RNA聚合酶进行催化，转录出特异的反义RNA探针。以同样的方法设计检测HCMV-IE基因编码的mRNA的cDNA克隆pHM 124，它含有HCMV-IE基因的主要转录区域(UL123)中的外显子2、3和4，可以同样方法转录出特异的反义RNA探针^［4］。

使用RT-PCR技术检测HCMV的mRNA，特异性的引物根据欲检测的HCMV-mRNA相关基因而设计。目前已有商业合成的用于检测HCMV-mRNA的引物。常用的检测HCMV-mRNA的引物有(从5′-3′)^［8］：CCAAGGCCACGACGT-TCCTGCAGACTA(MIEi，上游)，TGCTCCTTGATTCTATGCCGCACCA(MIEi，下游)，CAACGAGAACCCCGAGAAAGATGT(MIEi，探针)；AGATGGACCTGATGTGTCACGGC-GG(pp150t，上游)，34(T)-TGTGTG(pp150t，下游)，ATGGACTATCACGACGGGCTCTC(pp150t，探针)；CACGGTCTGAATCTGCACAGAGCAA(HLAi，上游)，CCTGTTGGCTGAAGTCCAGAGTGTC(HLAi，下游)，GTGCTGGGCCTGCTCTTCCT(HLAi，探针)。另外，应用检测HCMV的MIE-mRNA的引物(上游5′-TCCACGCTGTTTTGACCTCCA-3′，下游5′-GGCCCTCG TCAGGATTATC-3′)所合成的cDNA产物为166bp，敏感性达到～250 fg的RNA总量，当仅有一个HCMV感染的细胞表达mRNA时即可被检测出^［1］。

(三)mRNA检测技术与其它检测方法比较

检测出HCMV-mRNA阳性者，对于预测活动性HCMV感染的可靠性为30%～60%不等^［8，9］，但检测出HCMV-mRNA阴性者，无一人发生活动性HCMV感染，预测率为100%^［8］。1995年由Gozlan^［10］改良了检测HCMV的L-mRNA的方法，在人类免疫缺陷综合征(AIDS)病人和骨髓移植病人中证实其敏感性为81%和71%，诊断活动性感染的特异性均达到94%。

与病毒分离相比，后者由于花费时间长，不能在活动性HCMV感染的早期即做出诊断。

与DNA检测相比，无论是HCMV潜伏性感染或活动性感染，其DNA的复制都在进行，只是在活动性感染时很显著，在潜伏性感染时水平低。因此，定性地检测出白细胞中有HCMV-DNA，不能说明病人是否会发生活动性HCMV感染，预测率仅为38%～66.6%^［11］。而当HCMV-mRNA检测为阴性，病人未表现出活动性感染时，HCMV-DNA也有阳性的结果出现^［8］。因此，PCR技术在诊断HCMV-DNA血症的同时，不能区分潜伏病毒感染和活动性感染^［12］。

与病毒抗原检测相比，当机体感染HCMV后，HCMV抗原常会在外周血白细胞中检测到，称为HCMV抗原血症。活动性HCMV感染时，病毒抗原血症的水平高、变化快，而在潜伏性感染时水平低或检测不出^［13］。HCMV抗原检测技术能在活动性HCMV感染的早期，甚至在临床上尚未出现症状时即做出诊断，实验证实其诊断活动性HCMV感染的敏感性可达95%～100%，特异性可达93%～100%^［13］。但同时有人报道这一检测技术存在着较高的假阳性，正常人也有阳性结果出现^［13］。从检测的时间上看，HCMV-mRNA检测可在活动性感染前2～3周即为阳性，而HCMV抗原血症常在活动性感染出现症状的同时或之前数日至一周为阳性^［4］。

与病毒抗体检测相比，在机体感染HCMV后不久，即会出现体液和细胞免疫反应。抗HCMV-IgM抗体出现早，是诊断HCMV原发感染和二次感染(包括内源性潜伏感染的复发和外源性病毒的再感染)的一项指标，但应用酶联免疫吸附(ELISA)技术检测原发HCMV感染的HCMV-IgM抗体阳性率仅为35%。无论潜伏性或活动性HCMV感染，抗HCMV-IgG抗体常在原发感染之后2～3周出现，并可相对恒定地在宿主中终身存在。因此，抗HCMV-IgG抗体阳性仅能说明病人曾感染过HCMV。

目前有人报道应用DNA-RNA杂交技术在抗HCMV抗体阴性的健康人中检测到HCMV的IE-mRNA，因此这一技术在诊断活动性HCMV感染时也存在着一定的假阳性。相比而言，RNA-RNA杂交比DNA-RNA杂交诊断活动性HCMV感染的敏感性高，更适合于临床诊断。

此外，有人曾经报道过在HCMV潜伏感染时，可由单核细胞中检测到病毒IE-mRNA，但无病毒晚期基因的转录和病毒颗粒的合成。而在活动性HCMV感染时，则可由单核细胞中检测到完整的病毒颗粒^［14］。在有免疫力的血清抗HCMV抗体阳性的无症状个体中，应用³⁵S