【摘要】目的了解Duchenne/Becker肌营养不良症(DMD/BMD)基因缺失的分布及其与表型的关系。 方法采用18对引物多重聚合酶链反应(mPCR)分两步对96例DMD/BMD进行筛查。 结果 用第一组引物检出49例缺失，第二组引物检出11例缺失，分别占全长cDNA探针检出缺失的79%和18%，两组引物检出缺失的总和占全部缺失的97%。60例缺失中，DMD42例(70%)，中间型3例(5%)，BMD13例(22%)，未分类2例(3%)。43例(72%)缺失分布于外显子44～52，17例(28%)分布于外显子1～19。结论基因缺失主要分布于基因3′侧外显子44～52和5′侧外显子12～19两个热区。临床表型与基因缺失类型有密切关系，41例移码缺失破坏了翻译阅读框架而导致基因功能丧失，表型为严重的DMD，11例整码缺失位于外显子2～43，基因部分功能保留，表型为较轻的中间型和BMD。

Detection of Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD) gene deletions and its association with phenotype

Liu Yuge, Liu Hui, Xie Bingdi.

Neurological Research Institute, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300052

【Abstract 】ObjectiveTo analyse the deletion distribution and the relation of distribution of gene deletions and phenotype in Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD). MethodsNinety-six patients with DMD/BMD were screened with the multiplex polymerase chain reaction (mPCR) amplification using 18 pairs of primers. ResultsForty-nine deletions were detected with the first set and 11 with the second set which accounted for 79% and 18% of those detected by full length cDNA probes respectively. These two multiplex reactions detected about 97% of deletions in DMD/BMD patients. In 60 deletions, 42 were of DMD (70%), 3 intermediate (5%), 13 BMD (22%), and 2 cases (3%) were not classified. Forty-three deletions (72%) were located in exons 44～52 and 17 (28%) in exons 1～19. ConclusionsThe gene deletions were mainly distributed in the 3′ terminus of the gene central region around exons 44～52 and 5′ terminus of the gene around exons 12～19. The phenotype was associated with the type of gene deletion in DMD/BMD. The phenotype of 41 frameshift deletions was severe DMD, which disrupted the reading frame, resulting in the loss of the gene function. The phenotype of 11 in -frame deletions distributed in exons 2～43 with partial gene functions was intermediate patient and BMD.

【Key words 】Polymerase chain reactionMuscular dystrophyGene deletion

Duchenne/Becker肌营养不良症(DMD/BMD)是一种常见的X连锁隐性遗传性疾病，二者是等位基因疾病，发病率分别为新生男婴的1/3 500和1/30 000。1/3由新生突变引起^［1］。近年对DMD/BMD的研究取得了新的进展，致病基因已定位于Xp21，基因长2 300kb，含70个外显子，编码一种位于肌细胞膜上的骨架蛋白-“肌营养不良蛋白”(dystrophin)，基因缺失或重复均导致进行性肌营养不良症^［2，3］。Chamberlain等^［4］采用9对引物多重聚合酶链反应(mPCR)检出DMD/BMD基因缺失的80%，Beggs等^［5］设计了另外9对引物并联合应用这两组引物检出基因缺失的98%，从而对本病基因检测建立了一种简便快速的诊断方法。本组参照上述引物序列合成18对引物，对我院经临床，肌电图，血清酶学和肌活检确诊的96例无亲缘关系的DMD/BMD进行基因缺失筛查，并对我国DMD/BMD基因缺失的分布及其与临床表型的关系进行初步探讨。

对象和方法

一、对象

96例患者均为我院1992～1996年住院或门诊患者，均为男性，发病年龄6～18岁(平均12.4±3.3岁)，根据丧失行走能力的年龄将患者分为4型：(1)Duchenne型(DMD)65例(68%)，8～13岁以前丧失行走能力；(2)中间型6例(6%)，13～16岁丧失行走能力；(3)Becker型(BMD)20例(21%)，16岁后仍能行走；(4)5例(5%)8岁以下患者未能分型。临床均表现为四肢近端对称性进行性加重的肌肉萎缩，70%伴有腓肠肌或二头肌假肥大，均有Gower征阳性。肌电图检查显示典型肌源性改变，血清肌酸磷酸激酶(CK)及其同功酶MCK均显著增高，肌活检显示镶嵌分布的肌纤维萎缩，肥大，玻璃样变和坏死等典型病理改变。30例正常对照均为非神经肌病患者。

二、测定方法

1.DNA的提取：抽取患者和正常对照外周血5 ml，加入0.2%依地酸，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用等渗溶血法裂解红细胞后离心分离白细胞，加入1%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K，37℃消化4～6小时，再加入1/3体积的饱和氯化钠，离心除去沉淀，用等体积的氯仿抽提两次，2.5倍体积的无水乙醇沉淀，75%乙醇漂洗，晾干后溶于TE(10 mmol/L Tris.CI, 1 mmol/L EDTA，pH 7.6)，-20℃保存。

2.mPCR：18对引物参照Chamberlain和Beggs等^［4，5］提供的序列由美国CyberSyn公司合成，经寡核苷酸纯化柱(OPC)纯化。将18对引物分为两组(第1组：外显子4，8，12，17，19，44，45，48，51；第2组：启动子，外显子3，6，13，43，47，50，52，60)，分两步对全组患者进行mPCR扩增。50 μl PCR反应体系含670 mmol Tris-HCl(pH 8.0)，166mmol(NH4)2SO4，67 mmol MgCl₂，10 mmol β-巯基乙醇，10 μg/μl小牛血清白蛋白(BSA)，25 mmol dNTP，每对引物各0.25 μmol，模板DNA 500 ng。将反应液97℃予变性10分钟，加入5UTaqDNA聚合酶(德国BM产品)，混匀后加入35 μl石蜡油。按照94℃变性30秒，56℃复性30秒，70℃延伸2分钟进行30次循环，最后70℃延伸7分钟。取10 μl扩增产物用2%琼脂糖或6%聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TBE中电泳，溴化已锭染色，在紫外灯下观察结果并摄影，或用0.2%硝酸银染色保留结果。

结果

96例患者用18对引物mPCR扩增共检出60例缺失，其中用第1组引物检出49例缺失，检出率为51%，用第2组引物在未检出缺失的47例中检出11例缺失，检出率为12%(图1，2)。两组引物检出的总缺失率为63%。60例缺失中DMD42例(70%)，中间型3例(5%)，BMD13例(22%)，未分类2例(3%)；41例为移码缺失，19例为整码缺失。全部缺失均经全长cDNA探针(1-2，2b-3,4-5a,5b-7，8，9-14)(质粒由Kunkel教授赠送)Southern杂交证实，用18对引物检出的缺失占全长cDNA探针检出缺失的97%。因两组引物均未覆盖基因中心区，用cDNA探针4-5a和5b-7在这一区域内检出的两例缺失漏检，漏检率为3%。本组用外显子60未检出缺失，可能与病例数较少有关。两步mPCR检出基因3′侧外显子44～52缺失43例，占全部缺失的72%，5′侧外显子1～19缺失17例，占28%。30例正常对照均未见基因缺失。

1：扩增带大小标志(PBR322HinfI)；2：正常对照；3～7：DMD/BMD基因内缺失

图1第1组引物mPCR扩增DNA分析

1：正常对照；2～7：DMD/BMD不同基因内缺失

图2第2组引物mPCR扩增DNA分析

讨论

一、应用mPCR技术

mPCR技术的应用对于DNA分析是一种革命性的探索。以往DMD/BMD基因缺失需要使用七个不同的亚克隆cDNA探针检测，基因组DNA至少需用两种不同的限制性内切酶消化，检测步骤极其繁琐。应用mPCR技术大大检化了Southern印迹分析，根据大部分缺失集中在两个区域的理论，仅检测70个外显子中的一部分即可检测出大部分缺失。Chamberlain等^［4］首先在基因3′侧和5′侧以9个缺失热点外显子(4，8，12，17，19，44，45，48，51)的旁侧序列设计了9对引物，一次mPCR扩增即可检出用全长cDNA探针检出缺失的80%。

二、应用引物扩增

Beggs等^［5］在mPCR研究的基础上选择另外8个缺失热点外显子(3，6，13，43，47，50，52，60)和启动子设计了相应的9对引物，进一步扩大了缺失的检测范围，使本病基因缺失检出率达到98%以上。上述两组引物联合应用不仅能扩增外显子44～52缺失热区内的大部分外显子，而且还能检测5′端和基因远端的缺失，并可分析突变对翻译阅读框架的影响。

三、与Southern印迹分析比较

本组应用18对引物对96例DMD/BMD进行两步mPCR扩增结果与Southern印迹分析的结果一致。第1组引物检出49例缺失，占全长cDNA探针检出缺失的79%，第2组引物检出11例缺失，占全长cDNA探针检出缺失的18%，两组引物检出缺失的总和占Southern印迹分析检出缺失的97%。这一结果与国外文献报道的缺失检出率接近^［5，6］。实践证明这两组引物也适用于中国人DMD的基因诊断。应该指出的是，应用mPCR可以避免Southern杂交在基因诊断中的某些失误，例如两例应用c