资料及方法:
1.标本来源:标本来源于1994年10月~1996年10月,在本院妇产科自然分娩的早产儿18例,胎龄31~36周,体重2080±586 g;足月儿20例,胎龄37~42周,体重3 587±269 g。以上病例产妇在3天前均无发热、寒战及血象明显增高现象,脐带血培养均阴性。
2.mRNA原位杂交:(1)随机引物标记生物素IL-6 cDNA,采用常规方法,IL-6 cDNA片段为1.2 kb(由北京医科大学马大龙教授提供)。(2)标本制备:常规无菌取脐带静脉血5 ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分层液分离CBMC,滴在载玻片上,用多聚甲醛一戊二醛固定65℃30分钟。(3)杂交前处理:标本经10μg/L蛋白酶K消化,酒精梯度脱水,室温晾干。(4)载玻片上滴含有生物素标记IL-6 cDNA探针杂交液(20%硫酸葡聚糖/甲酰胺2×杂交缓冲液氧钒苷复合物RVC)42℃温盒过夜。(5)杂交后处理:常规洗片,用碱性磷酸酶SA-AP37℃30分钟,NBT/BCIP显色2~3小时,0.5%核固红复染后镜下观察,细胞图像扫描100个细胞(北京医科大学细胞图像扫描室)测定积分光密度(IA)。(6)阴性对照:杂交前标本经RNase处理杂交液中不加生物素化IL-6探针。
结果:早产儿的IA为18 511±3 649,足月儿为32 078±2 416,早产儿自然表达明显低于足月儿,差异有非常显著意义(t=3.92,P<0.001)。
讨论:新生儿,特别是未成熟儿,其产生抗细菌抵抗能力低下,在受到感染后,其成熟B淋巴细胞产生抗体能力低下,而T细胞又处于成熟障碍,同时造血细胞进入循环池呈延迟现象。IL-6在促进B细胞产生抗体、调节粒细胞功能方面具有重要作用。本研究结果表明,自然分娩早产儿,其IL-6 mRNA在CBMC内自然表达状态明显低于足月新生儿,机理尚不清。Keneth等研究发现,在早产儿CBMC及足月儿CBMC受到LPS及IL-1刺激后,早产儿CBMC iL-6蛋白质及mRNA在细胞内含量明显低于足月新生儿。早产儿CBMC自然状态IL-6 mRNA低水平表达与其抗体产生和中性粒细胞功能暂时性低下的关系,有待于进一步研究。
作者认为,应用细胞原位杂交技术检测mRNA基因表达具有直观性,应用细胞图像分析技术,可以进行细胞水平的半定量分析,细胞图像分析较斑点杂交更为敏感。
