【摘要】目的探讨抗T细胞免疫毒素(immunotoxin, IT)体外对脐血T细胞的清除效率及对造血干/祖细胞的影响。方法(1)用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术法(APAAP)分别测定了脐血、骨髓、外周血标本CD⁺₅、CD⁺₈ T细胞的百分率；(2)用单向混合淋巴细胞培养(MLC)方法比较了外周血与脐血MLC增殖反应；(3)分别用MLC法和噻唑蓝(MTT)比色法，观察了两组抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体(CD⁺₅、CD⁺₈)与完整蓖麻毒素(Ricin)偶联制备的两组免疫毒素(CD₅：Ricin、CD₈：Ricin) 对脐血T细胞增殖反应及对T淋巴细胞转化功能抑制的影响；(4)用造血祖细胞培养的方法观察两组免疫毒素对脐血粒单系祖细胞(CFU-GM)、早期红系祖细胞(BFU-E)及混合系祖细胞(CFU-Mix)的影响。结果(1)脐血含有一定比例的CD⁺₅及CD⁺₈ T细胞亚群；(2)在MLC中外周血与脐血对异源抗原的增殖反应相似；(3) CD₅：Ricin 10^-10～10^-8 mmol/L (M)、CD₈：Ricin在10^-9～10^-8mmol/L浓度范围内均能有效降低脐血T淋巴细胞在MLC中的增殖反应，并能有效抑制T淋巴细胞转化功能；(4)两组IT在10^-10～10^-9mmol/L浓度下对三种造血祖细胞增殖反应无明显影响。结论CD₅:Ricin、CD₈:Ricin在一定剂量范围内可以安全有效地去除脐血中T细胞，并且对造血祖细胞无明显影响。

Effects of immunotoxin on the depletion of T cells and on hematopoietic progenitor cells in human cord blood

Xu Manchun, L Shangen, Shen Beifen, et al.

^*Department of Pediatrics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo study the selective toxicity of immunotoxin (IT) on T cells and to determine its effect on hematopoietic progenitor cells.MethodsThe percentage of CD⁺₅ and CD⁺₈ T cell subsets in cord blood (CB) and bone marrow (BM) as well as peripheral blood (PB) was measured by using alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP) technique. One-way mixed lymphocyte culture (MLC) was performed to compare the proliferative response of CB with that of PB. The proliferative capability of cord blood T cells and T lymphocytes transformation capacity were evaluated in the presence of anti-CD₈ or anti-CD₅ immunotoxin by one-way MLC and colorimetric MTT (tetrazolium) assay, respectively. The effects of IT on the growth of hematopoietic progenitor cells of colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM), burst forming unit-erythroid (BFU-E) and multipotential hematopoietic progenitors (CFU-Mix) from CB were estimated by colony-forming assays.Results(1) A certain proportion of CD⁺₅ and CD⁺₈ T cells existed in CB. (2) The alloproliferative capacity of CB was the same as that of PB. (3) CD₅:Ricin at the dosage of 10^-10～10^-8 mmol/L (M) and CD₈:Ricin at the range of 10^-9～10^-8 M could effectively decrease both the proliferative capability of CB and T cell transformation. (4) At the range of 10^-10～10^-9 M, both kinds of IT didn′t affect the growth of hematopoietic progenitor cells.ConclusionGraft versus host disease (GVHD) might occur after cord blood transplantation (CBT). CD₅:Ricin and CD₈:Ricin might effictively deplete T cell and might potentially be used to decrease and prevent GVHD in HLA-mismatched related and unrelated CBT.

【Key words】Fetal bloodImmunotoxinsT-lymphocytesHemotopoietic stem cells

脐血是造血干细胞移植的又一重要供源。脐血移植(CBT)亦可发生不同程度的移植物抗宿主病(GVHD)，尤其是人类白细胞抗原(HLA)配型不合的CBT^［1］。已知GVHD与T细胞的数量和特性有极密切的关系。在异基因骨髓移植(BMT)中采用抗T细胞免疫毒素能安全有效地去除骨髓中T细胞，并已取得了预防和减轻重度GVHD的效果^［2］。但有关用免疫毒素去除脐血T细胞的研究在国内外尚未见报道。对此，我们进行了一些研究，现报告如下。

材料和方法

一、标本

1.脐血：采自正常分娩的健康产妇，胎盘未脱离母体前在脐带断端留取标本(5份)，后加肝素25 U/ml抗凝。

2.外周血：采自健康献血员新鲜静脉血(4份)。

3.骨髓：采自胸外科手术切除的非病理性肋骨(3份)。

二、主要试剂及材料

抗CD₅、抗CD₈单抗与蓖麻毒素(Ricin)组成的抗T细胞免疫毒素(CD₅：Ricin, CD₈:Ricin)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)均为军事医学科学院三所分子免疫室研制；促红细胞生成素(EPO)为日本Toyobo公司产品；噻唑蓝(MTT)为Servar公司产品；³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)为中国原子能研究所生产；植物血凝素(PHA-P)、2-巯基乙醇(2-ME)：购自Sigma公司；碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)试剂盒由北京帮定生物医学公司提供。

三、实验方法

1.APAAP法测脐血、外周血、骨髓中CD⁺₅、CD⁺₈ T细胞亚群。

2.单向混合淋巴细胞(MLC)方法：按参考文献［3］的方法；免疫毒素去除T细胞的方法：按参考文献［4］的方法。MLC实验结果分别以每分钟脉冲数(cpm)、刺激指数(SI)值、相对反应(RR)值及增加cpm(Δcpm)表示。

Δcpm=实验组平均cpm-对照组培养cpm

以未用免疫毒素(IT)为对照组的增殖反应率为100%，经IT作用后：

残留T细胞增殖反应率=

3.MTT法测定脐血T淋巴细胞转化功能：参考文献［5］。T淋巴细胞转化功能以SI值表示：

以未用IT为对照组的T淋巴细胞转化功能为100%，则：

IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制率=

4.造血细胞培养：经不同浓度免疫毒素处理后的脐血单个核细胞分别做粒单系祖细胞(CFU-GM)培养、早期红系祖细胞(BFU-E)培养：按参考文献［4］的方法及混合系祖细胞(CFU-Mix)培养：按参考文献［6］的方法。以未用IT为对照组的造血祖细胞增殖率为100%，经IT处理后：

造血祖细胞增殖率=

5.统计学处理：实验数据以平均数±标准差(±s)、中位数(M)表示；两组比较采用t检验；方差不齐用秩和检验；多组比较采用F检验。

结果

一、脐血CD⁺₅、CD⁺₈细胞含量与外周血、骨髓比较

我们观察脐血(5份)、外周血(4份)和骨髓(3份)的CD⁺₅、CD⁺₈细胞的百分率，结果脐血分别为47.0±7.6和19.9±5.1；外周血分别为59.4±7.2和23.9±3.3；骨髓分别为12.9±2.1和5.9±3.1。三组比较经F检验，P＜0.01。提示脐血中含有一定比例的CD⁺₅、CD⁺₈细胞，其含量低于外周血，高于骨髓。

二、脐血与外周血在单向MLC中增殖反应的比较

在MLC中，以RR值或Δcpm表示，经秩和检验脐血增殖反应与外周血无统计学差异。而脐血SI值低于外周血，差异有显著意义。原因是SI值易受自身对照增殖反应的影响，在MLC中，脐血自身cpm(5 815±3 053，中位数5 786)明显高于外周血cpm(2 035±1 644，中位数1 687)，秩和检验u=2.8, P＜0.01。因此结果提示脐血与外周血有同样的增殖反应能力(表1)。