摘要：目的：在体内和体外观察健脾理气中药对端粒酶活性的影响，探讨其抗肿瘤治疗的作用机制。方法：采用TRAP方法，观察H₂₂肝癌荷瘤小鼠在服用健脾理气中药后肿瘤端粒酶活性的变化，以及健脾理气中药对体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721端粒酶活性的影响。结果：体内实验显示中药组端粒酶的活性明显低于对照组(P=0.038)。体外实验表明，健脾理气冲剂对SMMC-7721细胞的端粒酶活性有抑制作用。结论：对肿瘤细胞端粒酶活性的抑制可能是健脾理气中药抗肿瘤作用机制的一部分。

中图分类号：R735.705文献标识码：B文章编号：1006-3250(2000)01-0070-03

Inhibition of telomerase activity by JianPiLiQi formula in liver cancer.

Meng zhiqiangYu erxinSong mingzhiHuang wenxia.

（Cancer Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai200032）

Abstract:Objective:JianPiLiQi method is one of important parts in cancer especially the liver cancer clinical treatment process.Telomerase,an RNA-dependent DNA polymerase that used by cancer cells to solve the continued-shorted telomeres caused by end replication question.Therefore the cancer cell achieved an unlimited replicated age by this mechanism but somatic cell not.Activation and up-regulation of telomerase are considered to be an important role in the genesis and development of cancer,and it becomes a hot point in cancer research.The aim is to investigate the anti-cancer mechanism of JianPiLiQi formula by observing the inhibition of telomerase activity in vivo and in vitro.Methods:The JianPiLiQi formula we used in our study is made up of ten Chinese traditional medicines:amyda sinensis,micromelum falcatum,crataegus pinnatifida,codonopsis pilosula,poncirus trifoliata,akebia quinata,oldenlandia diffusa,poria cocos,et al.In vivo,treated with JianPiLiQi formula from the second day after inoculated the HAC mouse liver cancer cell into armpit of mice.The administration of JianPiLiQi formula is 30 g/kg and mice were killed at 14^th day.In vitro,the IC₅₀concentrations in SMMC-7721 human liver cell mensurated by MTT method at third and firth days are 47 mg/ml and 32 mg/ml respectively.The drug concentration we used in cell culture is 40 mg/ml.The culture times are 1,3,5 days and removed drug followed 2 days culture respectively.Telomerase activity detection used Telomeric Repeat amplification Protocol(TRAP)combined with polyacrlamide and agarose gels eletrophresis(PAGE) silver staining.Results:In vivo,JiPiLIQi formula have a 38% cancer inhibition rate,and the cancer telomerase activity in treatment group obvious lower than control (P=0.038)；in vitro,JianPiLiQi formula inhibited telomerase activity in SMMC-7721 liver cancer cell,the inhibited effect is associated with time.The activity of enzyme is no obvious inhibition in first day and medial inhibition in third days,but in firth day the inhibition is obvious.In addition,telomerase activity can resume in some degree when removed drug and followed 2 days culture.Conclusions:Our study showed JianPiLiQi formula is a good method in liver cancer treatment,telomerase activity inhibition should be one part of its anti-cancer mechanisms.And the anti-cancer effect by jianPiLiQi formula is inhibition but not kill.

Key words:Telomerase, Liver Carcinoma,Chinese herbs

健脾理气方法在肿瘤的治疗尤其是在肝癌的临床治疗中，有着重要的作用，同时也取得了较好的疗效，成为肝癌综合治疗的一部分。端粒(Telomere)是真核动物细胞染色体末端的一个特殊结构，它是由TTAGGG6个碱基的重复序列组成，有稳定染色体的作用，并参与DNA的复制。端粒的重复序列在每次细胞分裂后都要缩短，即所谓的末端复制问题。在缺乏末端复制问题的分子补偿机制的情况下，端粒的不完全复制将传给子代细胞，当端粒的长度缩短到一定程度时，细胞停止分裂进入衰老。而肿瘤细胞能够摆脱衰老的表型变为不死，往往伴随着端粒酶(Telomerase,一种能够在染色体末端合成新的端粒序列的核糖核蛋白)的活化或功能的上调。大多数的研究发现，人类肿瘤含有端粒酶的活化，这些肿瘤缺乏调节端粒酶的机制，不能下调端粒酶的活性使细胞停止分裂和退出细胞周期^［1］。端粒酶在肿瘤的发生发展中有重要的作用，成为现代肿瘤研究的一个新的热点。本文采用TRAP法在体内观察小鼠H₂₂肝癌和体外人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性经健脾理气中药治疗后的变化。

方法

1实验材料

小鼠H₂₂肝癌细胞株由上海市医药工业研究院提供；人肝癌SMMC-7721细胞株由上医大中山医院中心实验室赠送；昆明种小鼠从上医大实验动物中心购得；所用PCR仪为美国GeneAmp® pCR System 7500；健脾理气冲剂由我院药剂科制备(由白术、山楂、党参、枳壳、八月札、茯苓等10味中药组成，每克冲剂含生药6.37 g。)

2动物实验

昆明种小鼠(体重20 g±2 g)20只分为对照组和治疗组(各10只)，取H₂₂小鼠肝癌细胞1.5×10⁶个接种于右腋皮下，接种的当天始以健脾理气冲剂灌胃，每次0.3 ml， 每日2次，相当于生药剂量30 g/kg体重；对照组用生理盐水灌胃0.3 ml/次，每日2次，14d后处死小鼠，摘取瘤块，称重后，生理盐水洗净血液，液氮中保存。

3细胞实验

人肝癌SMMC-7721细胞培养于1640培养液(Gibco产品，含10%的小牛血清)。用MTT法测定健脾理气冲剂对细胞的生长抑制率，其3、5d的IC₅₀(50%的细胞抑制率)分别为47 mg/ml和32 mg/ml。在培养时使用40 mg/ml处理细胞。使用前0.25%的胰酶消化计数，取1×10⁶接种于新培养瓶内预培养24h后，换新培养液并加入健脾理气中药(将健脾理气冲剂溶于双蒸水，滤纸过滤2遍，微孔滤膜过滤1遍，高压蒸汽灭菌后，调整药物的pH值至7.2)，使终浓度为40 mg/ml。培养1、3、5d并分别祛除药物再培养2d，计数取7×10⁵细胞，冰冷PBS洗3遍后放置Eppendorf管中,-70℃保存。

4端粒酶的抽提

4.1瘤块的端粒酶抽提

将瘤块放入高压消毒的不锈钢液氮研磨筒内磨碎，取80mg～100mg放入Eppendorf管中，加入1×CHAPS裂解缓冲液200μl，冰浴30 min后，14000 g 4℃离心30 min，吸取上清，速冻于-70℃低温冰箱。

4.2细胞的端粒酶提取

将收集的细胞中加入1×CHAPS缓冲液200μl，其余步骤同上。

5TRAP分析

5.1采用考马斯亮蓝G-250染色法

对抽提的产物进行蛋白定量，将蛋白的浓度稀释至0.5 ug/ul，以便使TRAP分析比较时保持在同一水平。

5.2端粒酶活性测定

采用Oncor公司的TRAP-eze^TM端粒酶检测试剂盒。在50μl pCR总反应体积中加入：10×Buffer 5μl，50×dNTP、TS Primer、TRAP primer Mix各1μl、Taq酶2u，端粒酶抽提物2 μl。30℃温育30 min后，按94℃30s，60℃30s程序PCR扩增30个循环。

5.3TRAP产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析

将PCR产物25μl进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200V，缓冲液为0.5×TBE，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止，取出凝胶进行银染。步骤：将凝胶在双蒸水中漂洗后，10%乙醇固定10 min，1%硝酸脱色10 min,0.2%硝酸银染色15 min，然后用3%的无水碳酸钠(每升含甲醛1 ml，1%Na₂S₂O₃100μl)显色至所需条带出现而背景不至于过深为至。显色完毕后，用10%乙醇固定，拍照。端粒酶凝胶电泳的阳性结果为有间隔6个碱基对的阶梯状条带的出现。

5.4半定量分析

用Alpha Innotech Corporation 的IS1000 Image Analysis System对图像进行半定量分析。将端粒酶含梯状条带的总强度除以内对照条带的强度，得到半定量的数值。

6本文所用统计结果均用SPSS for Windows version 7.5软件分析。

结果

1瘤块称重结果显示，中药组重量(0.706 g±0.412 g)明显小于对照组(1.318 g±0.505 g)，P=0.019。

2小鼠瘤块的端粒酶活性测定半定量分析结果经统计分析后显示，健脾理气中药组瘤块的端粒酶活性(0.58)较对照组(1.09)要低(P=0.38)(见图1)。

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