摘要：目的：探讨中药对延缓DHE耐受小鼠脑内的下丘脑以及杏仁核CCKmRNA表达的影响。方法：采用热板法，以添足底反应潜伏期为痛阈。Q500IW软包分析小鼠脑内CCKmRNA表达量。结果：小鼠接受混合中药后，从第3d开始到第7d为止，AUC值一直保持较高的水平。第7dAUC值与单纯DHE组比较，前者为(4458.4±1357.6)，而后者(1773.6±1144.2)，两者存在差异有显著意义(P＜0.05)。CCKmRNA原位杂交信号经图像处理结果：下丘脑和杏仁核CCKmRNA表达，耐受组分别为103.92和181.19，明显高于混合中药组和对照组(45.72和70.13)P＜0.05，而中药组为51.03和92.29与对照组相比无明显差异P＞0.05。结论：DHE耐受小鼠，脑内下丘脑和杏仁核CCKmRNA表达的增加，可能是产生DHE耐受的原因之一。

中图分类号：R285.5文献标识码：B

文章编号：1006-3250(1999)12-0064-03

阿片类药物长期应用于慢性疼痛病人，病人产生耐受是不可避免的。如何预防治疗或延缓阿片类药物耐受的产生是迫切需要解决的问题。我们在临床治疗晚期癌痛的实践中，发现阿片类药物-双氢埃托啡(dihydroetorphineHCl简称DHE)按时、按病人整体状况，加用混合中药(MCHs)比单独应用DHE达到痛缓解所需要的DHE量显著减少，产生耐受的时间也明显延缓，大部分需要增加药量的病人也多为疾病发展的需要^［1］。本实验试图从分子生物学方面研究中药延缓DHE耐受的部分机理。

材料与方法

1实验动物

体重15～16g，雌性，昆明小鼠(上海医科大学动物部提供)。分笼饲养2d，保持正常的食物和水供应，日光12h，黑暗12h。

2主要药品来源和制备

DHE针剂(0.4mg/ml)由北京军事医学院提供。DIG寡核苷酸末端标记试剂盒(BochringerMannheim公司)，CCK探针序列为5’GCCCATGTAAGTCCCCGTCACTTAT-3’(美国Dr.BaiLu馈赠)。中药葛根水煎，煎浓缩至40%浓度，吴茱萸打成粉末，95%乙醇提取，回收乙醇，用水稀释至40%浓度。

3实验方法

痛阈测定及评估：

采用热板法测定小鼠的痛阈，镇痛百分率=(Tt-T0/Tc-T0)×100%。镇痛效果曲线下面积(AUC)，取镇痛百分率作为纵坐标，反应潜伏期(min)作为横坐标。

动物分线和用药：

筛选30只，随机分成三组。(1)DHE组：单独给DHE(6μg/kg)，s.c.q.d连续7d。(2)中药(MCHs+DHE)组：DHE(6μg/kg),s.c.前30min，给MCHs(葛根、吴茱萸)灌胃(0.2ml/10g体重)q.d连续7d。(3)正常组：不给DHE，用NS灌胃(0.2ml/10g体重)q.d连续7d。

4原位杂交

小鼠，于末次给药24h后，进行心脏灌注，脑冰冻切片，厚度35μm。(1)脑片预处理：用0.1MPBS(pH7.2)，漂洗两次，再用4%多聚甲醛固定5min，放入1μm/ml蛋白酶K溶液(37℃)中消化20min，再置入0.25醋酸酐和0.1M三乙醇胺内漂洗20min，最后用50%甲酰胺5XSSC胺溶液预杂交30min。(2)杂交反应：DIG标记CCK探针用杂交溶液稀释，终浓度为200pg/ml.脑片于其中进行杂交(约4片/0.1ml)，37℃孵育16～18h。(3)显色反应：脑片移入2XSSC和0.1XSSC中各漂洗两次，洗去未结合的CCK探针，此后BufferⅠ漂洗一次，BufferⅡ37℃预孵育30min后，置入抗DIG碱性磷酸酶复合物(1∶1000稀释于抗体稀释液)中，室温反应4h，移入NBT和BCIP显色液内避光显色6h，最后用TE液终止显色反应。(4)切片贴于载玻片上，树胶封片。

5图像处理

应用图像处理系统Q500IW(Image-anaalysis，DX-系统，上海交通大图像处理与模式识别研究所提供)进行各脑组织片灰度测定。每只动物至少选出相邻部位的两张脑片。

结果

1MCHs对DHE镇痛耐受作用的影响

小鼠接受MCHs后(由图1可见)，中药组从第3d开始到第7d为止，AUC值一直保持较高的水平。第7d的AUC值与DHE组比较，前者为(4458.4±1357.6)，而后者(1773.6±1144.2)，两者存在差异有显著意义(P＜0.05)。提示MCHs具有对抗或延缓DHE镇痛耐受作用。

图1混合中药对小鼠DHE镇痛作用的影响

2不同处理组之间小鼠脑内CCKmRNA表达的比较

原位杂交脑组织切片经图像处理，以灰度值(I.O.D)做纵坐标，由图2所见，DHE组下丘脑和杏仁核群CCKmRNA表达灰度值(I.O.D)分别为(103.91±67.59)和(181.19±84.74)明显高于对照组(45.72±39.22和70.13±66.10)P＜0.05；而中药组CCKmRNA表达水平为51.03±45.86和92.09±64.44与对照组比较未见明显差异P＞0.05，而与DHE组比较则有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，混合中药起到抑制是由于长期给予DHE所引起的脑内CCKmRNA表达。

图2不同处理组小鼠脑内CCKmRNA的表达比较

讨论

通过长期临床实践，我们发现疼痛病人经中西医治疗，可以提高止痛效果，并延缓DHE耐受出现的时间，表现为混合中药合并DHE比单独DHE达到缓解疼痛所需要的量少。动物实验证实了，小鼠联合应用混合中药和DHE，可使在第7d的镇痛作用明显高于单独DHE应用组，此结果的产生有三种存在的可能：(1)中药本身有镇痛作用。(2)中药和DHE合用有协同作用。(3)中药可以抑制或延缓吗啡耐受的发展。我们以往的工作，已经证实混合中药本身无镇痛效果也不影响吗啡的镇痛作用^［9］。因此，我们认为，中药可以抑制或延缓吗啡耐受发展的可能性最大。

关于阿片类药物的耐受性形成的机理，目前尚不甚清楚。有文献报道可能与中枢神经系统中μ阿片受体的下调^［2、3］，细胞内第二信使cAMP合成增加^［4、5］，与CCKmRNA过度表达有关^［6、8］。关于中药对抗阿片类药物的耐受报道不多。Takahashi，1992年报道了人参对应激小鼠(电刺激足底，心理刺激)吗啡耐受产生有抑制作用^［10］。本实验重点观察传统中药是否能改变小鼠脑内CCKmRNA的表达。阳性对照(DHE)组脑内CCKmRNA表达比正常对照组明显增强，而我们选用了温暖脾胃、肝、肾四经的中药——吴茱萸配以入脾胃太阳经的解痉中药——葛根制备成混合液，对于长期给予DHE所引起的脑内CCKmRNA表达起到了增强抑制作用。提示，混合中药直接起到延缓DHE耐受的发展部分机理。动物实验时间尚不够长，混合中药是通过如何途径来抑制脑内CCKmRNA的表达，还需要作进一步的深入研究。

参考文献

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［9］李其松，马鸿建.吴茱萸、葛根、大黄抗吗啡耐受作用的实验观察.上海医科大学 学报.1994，21：95-97.

［10］Takahashi M,Tokuyama S,Kaneto H:Anti stress effect of ginseng on the inh ibitioin of the development of morphine tolerance in stressed mice.JPN J Pharmac ol.1992，59:399-404.

(收稿日期1999—05—12修回日期1999—08—12)