摘要目的用大鼠皮肤致敏模型研究用雷公藤多甙(TⅡ)供体预处理对移植心脏成活的影响。方法SD大鼠作供体，Wistar大鼠作受体，A、B两组所有受体在心脏移植前均先用供体皮肤致敏，A组作单纯心脏移植，B组作经供体预处理后的供心移植，C组在单纯心脏移植前不作致敏处理。结果在细胞和体液免疫均较强的内环境中，B组移植供心成活时间均较其相应的对照组A组明显延长。结论TⅡ供体预处理能明显延长移植供心成活时间，该法简单实用，对降低术后免疫抑制剂用量及毒副作用有一定的意义。

中国图书分类号R285.1

环孢素A的使用已使心脏移植后5年成活率达60%，但其毒副作用和以移植心脏血管病变(CAVD)为主要表现的慢性排斥又跃生成为进一步提高远期成活的巨大障碍^［1］。移植前试图降低供心免疫原性，从而减轻术后免疫排斥已成为人们探求的方向。本实验目的就是用雷公藤多甙(TⅡ)供体预处理，观察它对供心成活的影响。

材料与方法

1实验方法

1.1动物

纯种Wistar大鼠，4月龄，300g～400g，雄性，做皮肤及心脏移植受体，SD大鼠(均由山东医科大学实验动物中心提供3月～4月龄，250g～300g，雌雄不限，做皮肤及心脏移植供体。

1.2皮肤移植

所有受体均在心脏移植前7d～9d移植2cm²供体全厚皮瓣于胸背部右侧以致敏大鼠，胸背部左侧移植相应大小的自体皮瓣对照，仔细剥除皮瓣下肌肉，术毕外敷青霉素干粉0.2g。

1.3供体预处理

雷公藤多甙粉剂(江苏泰州制药厂提供)2g以少量吐温80助溶后无菌生理盐水配成2%悬液消毒后冰箱保存，在心脏摘取前第1d和第2d及术前2h供体腹腔内注射50mg/kg.d，共3次。

1.4腹腔内异位心脏移植见文献^［2］

用2%戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔内注射麻醉后做供心摘取及移植，供心升主动脉与受体腹主动脉行端侧吻合，供心肺动脉与受体下腔静脉行端侧吻合，血液循环方式为：受体腹主动脉→供心主动脉→冠状循环→右心房→右心室→肺动脉→受体下腔静脉。移植物缺血时间在45min以内，75%的移植物在吻合结束除去阻断重新获得血流时，心肌立即开始收缩，手术天作为0d记。

2实验设计

A组于心脏移植前7d～9d先做皮肤移植，B组于皮肤移植后7d～9d做经供体预处理后的供心移植，C组单纯做心脏移植，每组各10只大鼠。

3观察指标

3.1每日经腹壁触摸心跳情况

扪不清时做心电图检查以记录供心成活天数，凡成活小于20h者均作为手术意外不参与实验。

3.2红细胞(RBC)免疫功能测定

皮肤移植前及移植后6d，心脏移植后第1d取鼠尾血0.5mL肝素抗凝用酵母菌花环法测RBC—C3bR花环和RBC—IC花环活性。以后若供心成活则每周测1次，切取供心当天最后测1次。

3.3皮肤迟发性超敏反映诱导

见文献^［3］略改进，无菌切取供体脾脏100目钢丝网研碎，洗涤过滤收集单个细胞，用RPMI1640液调细胞浓度为1×10⁷/0.2mL，4C冰箱保存备用。A、B两组早已被皮肤致敏，C组在心脏移植时于双侧腹股沟皮下各注射0.2mL脾细胞悬液以致敏大鼠，各组于排斥终点供心停跳摘取后次日于右后掌注射1×10⁷/0.2mL供体脾细胞，左后掌注射0.2mL的Hanks液对照，24h后游标卡尺则二脚掌厚度，以二者的厚差代表DTH程度。

3.4电子显微镜移植心脏检查

重点观察血管病变。

3.5供心MHC—Ⅱ免疫组化检查

用MaRIa小鼠抗大鼠Ia抗原单抗为一抗，异硫氰酸荧光黄标记羊抗鼠免疫球蛋白单抗(GAM-IgG-FITC)为二抗(北京军事医学科学院帮定生物医学公司提供)检查移植心脏MHC-Ⅱ变化情况。

3.6排斥终点移植心脏组织学变化

4统计学处理

全部数据用均数+-标准差表示，多样本均数比较用F检验，两两比较用q检验，两样本均数比较用t检验。等级资料比较用秩和检验。

结果

1各组供心成活情况

A组平均成活28.7±3.76h，B组为78.6±30.5h，C组未作供体皮肤致敏，平均成活时间为174.8±36h，经统计学处理各组间差异显著(P＜0.01)。在未发生排斥时供心跳动有力，心律齐，心率160次/分～190次/分，当发生排斥时，心搏减弱甚至扪不到，心电图示电压底心率慢，不齐，QRS波宽大畸形，最终停跳。

2RBC免疫功能变化

皮肤移植后6d各组RBC免疫功能均显著增高，心脏移植后第1d下降明显，但各组间无统计学差异(P＞0.05)，以后持续升高，到排斥终点供心停跳时测定值也达高峰，各组间比较无显著差异(P＞0.05)，见图1。

Ⅰ.before skin transplantation.

Ⅱ.7d after skin transplantation.

Ⅲ.1d after HT.Ⅳ.1w after HT.Ⅴ.2w after HT.

Fig 1 The changes of RBC immunity before and after heart transplantion

图1心脏移植前后红细胞免疫动态变化

3DTH变化

A组为2.1±0.3mm,B组为1.83±0.39mm,C组为1.96±0.25mm，各组间比较无显著差异(P＞0.05)。

4移植供心常规病理检查

按1990年国际心脏移植学会(ISHT)制订的急性心脏排斥反应诊断标准分级^［4］：A组为Ⅲb～Ⅳ级，B组为Ⅱ～Ⅲb级，C组为Ⅲb～Ⅳ级。经统计学处理B组和C组及和A组比较差异显著(P＜0.05)。

5移植心脏血管病变超微结构观察

A、B两组均内皮细胞肿胀，细胞结构不清，基底膜断裂，血细胞外渗，管腔内外均有大量电子致密物沉积，C组微血管病变稍轻，电子致密物沉积较少(图2、3)

图2B组微血管超微结构改变(1.5×6000)：内皮细胞溶解，基底膜断裂，红细胞及巨嗜细胞外渗，管腔内外电子致密物沉积

图3C组微血管超微结构改变(1.5×6000)内皮细胞结构不清，基底膜溶解，

宫腔内外电子致密物沉积不多。

6MHC-Ⅱ抗原免疫组化检查

共作3批次，第一次用液氮保存20多天的移植心脏检查无结果，第2及第3次采用直接切取新鲜标本送检亦无阳性结果。

讨论

1移植排斥超敏反应模型

1994年binder^［5］报道过该模型，它所诱发的排斥类似临床所见因反复输血、妊娠等已出现群体反应抗体(Panel reactive antibody PRA)阳性的患者，属超急性排斥，有细胞免疫参与，同时也有体液免疫参与，用此模型研究移植排斥可同时了解细胞和体液免疫情况也缩短了研究周期。本实验采用SD(Ag-B6)和Wistar(Ag-B2)两种纯种封闭群(远交)大鼠，它们的MHC完全不同，为高免疫应答者，在心、肾及皮肤移植后会出现严重排斥反应^［6］，SD→Witar大鼠心脏移植，从理论上讲，宿主的淋巴细胞对可供心抗原进行攻击，C组移植供心在7d左右便发生急性排斥也证明此点，而A组在28h左右发生排斥，供心病理检查有急性排斥表现，DTH反应强烈，超微检查有急性血管排斥表现，表明这种模型是有效的，心脏植入时宿主以处于高度细胞和体液免疫致敏状态。术后RBC免疫降低可能与手术创伤有关。

2免疫刺激细胞(immunostimulatory cell ISCs)是重要的抗原提呈细胞(APC)^［17］

涉及到心脏的主要是间质、血液和淋巴树突状细胞，属MHC—Ⅱ阳性^［8］，在同种异体移植时供心MHC—Ⅱ可直接提呈抗原，亦可被宿主APC间接提呈而启动排斥^［9］。由于ISCs强烈的免疫原性，Moller^［7］提出如果在供心植入前能将95%ISCs消除，移植供心便有可能在不用任何抗排斥措施下长期成活。近年来对雷公藤多甙(TⅡ)研究表明，它具有良好的免疫抑制抗排斥效果，作用环节类似CsA，但目前尚未见用于供体预处理方面的报道。本实验显示，经TⅡ供体预处理后的供心移植在RBC免疫和淋巴细胞增殖实验均显示很强的免疫内环境下能明显延长移植心脏成活时间，与对照比较差异显著，分析TⅡ对供心免疫原性有一定程度的影响，最大可能的作用对象便是ISCs。我们认为，该法简便实用，对