摘要分子生物学技术在生药学中应用研究方兴未艾。综述了DNA分子遗传标记技术在近缘易混淆生药鉴定、药材道地性研究、中药质量标准化、中医药古迹考证、药材种子种苗检测等方面的研究进展，并提出一些值得注意的问题以及今后可能的发展方向。

An Outlook on the Authentication of Traditional Chinese Drug (TCD) by DNA Molecular Markers

Xiao Xiaohe

(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)

Liu Fengqun

(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)

Yuan Hailong

(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)

He Chengshan

(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)

Shi Chenghe

Department of Pharmacy, General Hospital of Navy

AbstractIn view of the ever advancing molecular biology, the prospect to solve some problems on the identification of easily confusable species, the tracing of geo-herbal origin, the standardization of quality control criteria, the archaeological research of ancient remains and the examination of medicinal plant seeds and seedlings of TCD by DNA molecular markers were presented briefly.

Key wordspharmacognosyDNA molecular markersmolecular biological technique

当今生命科学不断取得重大突破，分子生物学和基因工程技术日趋成熟，从遗传物质DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定已成为可能。DNA分子遗传标记原理比较简单。依据多态性的检测手段，分子标记可分为三大类：a.基于传统Southern杂交技术的分子标记如限制性内切酶片段长度多态技术(RFLP)；b.基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增产物指纹(DAF)等；c.PCR-RFLP技术的结合即AFLP技术。依据在基因组中出现的频率，又可将分子标记分为低拷贝序列和重复序列，重复序列包括串联重复和散布重复。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，且不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景，并保持强劲的发展势头。笔者综述了DNA分子遗传标记技术在中药鉴定学中的应用发展。

1鉴定近缘生药品种

近几年RFLP、PCR、PAPD、AP-PCR、AFLP等DNA分子遗传标记技术已广泛应用于近缘生药品种的整理研究。如Wen等^［1］对人参属12 种植物的ITS区和5.8 S-rRNA基因进行了序列分析，结果表明美洲东北部2 个种西洋参Panax quinquefolius与三叶人参P. trifolius中，西洋参与东亚种人参、竹节参P. japonicus、三七P. notoginseng具有更近的亲缘关系，而且ITS序列证明人参、西洋参和三七不是一个单系群(monophyly)。Shaw等^［2］用RAPD标记法对人参属3 个品种(人参Panax genseng、西洋参P. quinquefolius、三七P. notogenseng)和4 种伪品(桔梗Platycodon grandiflorum、紫茉莉Mirabilis jalapa、栌兰Talinum paniculatum、商陆Phytolacca acinosa)进行了有效鉴别。Ngan等^［3］以保守的植物序列作引物，对核糖体ITS1-5，8S-ITS2的DNA序列进行了扩增，并藉以鉴定人参属6 种药用植物(Panax ginseng, P.quinquefolius, P.notoginseng P.japonicus, P.trifolius, P.major)以及2 种常见的人参伪品(紫茉莉和商陆)；利用RFLP标记技术对上述品种亦可进行有效的区分或鉴别。曹晖等^［4～6］利用18～24个碱基的6 种引物进行AP-PCR和用10 个碱基的OPC-6引物进行RAPD扩增，获得了菊科地胆草属2 种植物地胆草Elephantopus scaber、白花地胆草E.mollis和假地胆草属1 种植物假地胆草Pseudoelephantopus spicatus以及4 种商品苦地胆药材DNA指纹图谱，同时测算了其DNA指纹图谱的相似系数，据此可区别中药苦地胆及其混淆品白花地胆草和假地胆草。Yamazaki等^［7～9］利用OPD-2和OPE-2引物进行RAPD扩增，获取甘草属4 种药用植物光果甘草Glycyrrhiza glabra、甘草G. uralensis、刺甘草G. echinata和刺果甘草G. pallidiflora的DNA指纹图；以Bam H1、Dral、Eco12091、HinfⅠ和HcoⅠ酶解后与水稻rDNA基因pRR217进行分子杂交和RFLP指纹图分析，建立其亲缘关系树，结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近，这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与传统植物分类研究结果吻合。国内外学者运用RAPD、RFLP、AFLP等分子标记法对淫羊藿属Epimedium^［11］、黄芪属Astragalus^{［12，13］}、木蓝属Indigoferae^［14］、黄连属Coptis^{［15，16］}、山麦冬属Liriope^{［17，18］}、贝母属Fritillaria、栝楼属Trichosanthes、铁线莲属Climatis^［19］、香茶菜属Isodon^［20］、姜黄属Curcuma^［21］、苍术属Atractylodes^{［22～24］}、大麻属Cannabis^{［25～27］}、沙参属Adenophora^［28］、紫苏属Perilla^［29］、天南星属Arisaema^［30］、百合属Lilium^［10］、澳茄属Duboisia^［31］、莴苣属Lactuca^［32］、柑橘属Citrus^［33］等药用植物进行了较为系统的研究。

2鉴定名贵易混淆生药品种

珍稀名贵中药是祖国传统医药宝库的精粹之一，同时亦是生药品种混乱及伪劣药材的高频区。不少珍稀品种如冬虫夏草、番红花、金钗石斛、囊鞘麝香、穿山甲、犀角、虎骨、天然牛黄、天然熊胆、蛤士蚂、海马、玳瑁等来源有限，采用NDA分子遗传标记技术鉴定，取样量少，避免了贵重样品的损耗，即使从动植物生物标本上直接取样也不会造成标本整体的破坏，因而具有独到的优势。Fushimi等^［34］通过变异等位基因扩增技术(MASA)对mat K基因片段测序发现，人参P. ginseng与西洋参P. quinquefolius、竹节参P. japonicus间的mat K基因片段上第102号核苷酸序列不同，以此来鉴别人参、西洋参，结果非常可靠。陈月琴等^［35］采用末端终止法对杜仲大分子rRNA基因(25SrDNA)5′端基因进行测序，根据序列中核苷酸的变化可有效地鉴别杜仲与其它相关类群。

3鉴定动物类生药品种

DNA分子遗传标记技术不仅能对有形的动物药整体及破碎部分器官组织进行准确的鉴定，而且对以动物粉末、体液、分泌物和排泄物入药的生药及制剂进行有效的真伪鉴定、纯度检查与质量评价，如龟鳖胶囊、纯蛇粉、鹿血粉、犀角粉、水牛角粉和麝香等。

近年来国内动物药的DNA分子鉴定报道较多。如王亚胆等^［36］从保存9 年以上的药材龟板和鳖甲中提取出DNA，并用细胞色素b基因片段的通用引物对(引物间距500 bp)，通过PCR扩增到了长约500 bp的DNA片段，成功地对龟板和鳖甲进行了DNA指纹鉴定，为分子标记技术引进到中药鉴定提供了基础资料。王建云等^［37］利用陈旧皮革的DNA提取技术从鸡内金、鸭内金提取DNA，通过PCR技术，以线粒体DNA细胞素b(cyt-b)通用引物中的L14841和H15149为引物扩增片段，将扩增后的DNA用双脱氧链终止法测定其序列，表明鸡内金与鸭内金的DNA序列有明显差异，以此能准确鉴别鸡内金和鸭内金。王建云等^［38］采用微量DNA提取技术，在梅花鹿血、毛，鹿鞭，鹿茸，牛鞭，驴鞭中提取DNA，以线粒体DNA细胞色素b通用引物L14841和H15149扩增约307 bp DNA片段，扩增产物纯化后采用双脱氧链终止法测定其序列，结果证明梅花鹿毛、血和鹿鞭的DNA序列完全一样，而所谓的“鹿茸”则与其有较大的差异。王义权等^［39］将RAPD标记技术用于蛇类动物的分类学研究和鉴定，结果表明RAPD标记技术不仅能够用于蛇类动物种间系统演化、种内个体间遗传多样性，并且可以用于蛇类药材的鉴定。吴平等^［18］应用RAPD分析能有效地鉴定海马类药材。熊丽娟等^［40］用DNA序列分析法鉴别中药紫河车获得成功。

4鉴定药材道地性

在中医药长期医疗实践中，道地药材一直是评价药材品质的独特的综合性标准。道地药材与非道地药材物种来源一致或十分相近，在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相似性，因而道地药材的鉴别往往不容易，具有很大的主观性。

作为现代分子生物学技术重要的手段的DNA分子遣传标记方法，将使从居群和分子水平上阐明药材道地性的生物学实质成为可能。陈永久等^［41］利用RAPD技术研究了冬虫夏草Cordyceps sinensis的不同地理群体间的遗传分化现象，结果表明：来自同一地方的样品遗传差异甚微，同一区域不同地方的样品间遗传差异较大，不同区域的样品间遗传差异最大，这为冬虫夏草的药材道地性研究提供了分子水平的支持依据。肖小河^［21］研究表明，RAPD技术不仅能正确鉴别姜黄属不同种间群体，而且对种内等级亦能进行有效的刻划，可作为姜黄属药用植物