摘要探讨了银杏内酯B对体外血小板活化因子激活的大鼠中性白细胞某些功能，包括溶酶体酶的释放，超氧阴离子的产生以及细胞内游离钙浓度改变的影响。结果显示：银杏内酯B在0.5～100 μmol/L终浓度下，可使β-葡萄糖苷酸酶释放量降低44.2%～73.2%；在0.1～40 μmol/L终浓度下，可使超氧阴离子生量降低27.4%～50.0%；在0.1～100 μmol/L终浓度下，使PAF和fMLP刺激引起的细胞内游离钙浓度分别降低13.9%～51.4%和2.2%～36.6%。结果提示：抑制溶酶体酶的释放、超氧阴离子生成以及降低细胞内游离钙浓度的升高可能与其抗炎作用有关。

Effect of Ginkgolide B on the Fuction of Rat Polymorpho-Nuclear Leukocytes Activated by Platelet Activating Factor

Zhou Long'en

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing 100050)

Wang Wenjie

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing 100050)

Bai Jingye

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing 100050)

Chen Guifang

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing 100050)

AbstractTo investigate the effects of ginkgolide B on release of β-glucuronidase and the production of superoxide anion, as well as intracellular calcium change of rat polymorphonuclear leukocytes activated by platelet activating factor (PAF). β-glucuronidase release was quantitated by enzyme reaction in which phenophthaleinglucuronic acid was used as the substrate, superoxide anion production was determined by cytochrome C reduction, the change of intracellular calcium was measured by fluorescent indicator Fura-2/Am. In comparison with control, ginkgolide B at final concentration of 0.5～100 μmol/L inhibited β-glucuronidase release by 44.2%～73.2%； at final concentration of 0.1～40 μmol/L decreased superoxide anion production by 27.4%～50.0% and at final concentration of 0.1～100 μmol/L decreased the rise of intracellular calcium level induced by PAF and fMLP by 13.9%～51.4% and 2.2%～36.6% respectively. It is concluded that ginkgolide B can significantly affect the functions of rat polymorphonuclear leukocytes. Therefore, its inhibitory effects on lysosomol enzyme release, superoxide anion production and intracellular calcium increase induced by PAF may be related with its antiinflammation action.

Key wordsginkgolide BPAFsuperoxide anionβ-glucuronidaseintracellular calcium

银杏是我国古老树种之一，在我国已有600多年的药用历史。银杏叶中的主要药用成分之一银杏内酯 B(ginkgolide B)为强血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂，具有抑制血小板聚集、拮抗血管通透性增加、缓解支气管收缩、改善过敏症状等药理活性^［1，2］。近年来研究也发现，银杏内酯 B 具有较强的抗炎作用。中性白细胞是宿主防御系统的重要组成部分，又因参与炎症反应而能造成机体损伤，在 PAF 刺激下，发生一系列功能变化，如产生超氧阴离子和其他活性氧代谢物，脱颗粒并释放溶解体酶及细胞内游离钙［Ca²⁺］_i浓度的改变^［3］。我们采用中性白细胞体外温孵系统，观察银杏内酯 B 对 PAF 刺激下中性白细胞功能的影响。

1材料

1.1动物：Wistar 大鼠，体重 250～300 g，雌雄兼用，由中国医学科学院实验动物繁育场提供。

1.2药品和试剂：ginkgolide B,PAF,细胞松弛素 B(cytochalasin B)，细胞色素 C(cytochrome C)，酚酞葡萄糖醛酸(phenolphthalein glucuronic acid)，Micrococcus Lysodeikticus 购自美国 Sigma 公司，Fura-2/AM 由本所合成室提供。其他试剂均为国产分析纯。

1.3仪器：Hitachi F-4010 型双波长荧光分析仪和 Yamato BT-25 型震荡恒温水浴为日本生产。soniprep 150 超声细胞破碎仪为英国生产。Bio-Rad 500 型酶标仪为美国生产。LDZ4-0.8 自动平衡微型离心机为北京医用离心机厂生产。

2方法

2.1中性白细胞悬液的制备^［4］：大鼠在乙醚麻醉下，于右胸肋间注射1%角叉菜胶 0.2 mL，4 h 后断头处死，吸取胸腔渗出液，冰浴保存，加含 0.75% NH₄Cl 的 17 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7.2)除去混入的红细胞，2 000 r/min 离心 5 min，沉淀的中性白细胞以适当的 Dubecco′s 缓冲液洗涤并制成悬液。涂片以 Giemsa 染色，分类计数，中性白细胞数大于 95%。以苔盼蓝排斥法检测，活细胞数大于 98%。

2.2中性白细胞释放酶液的制备^［5，6］：中性白细胞以 Dulbecco′s 液悬浮，调节为 2.5×10⁶ 个细胞/mL，采用 10 mL 试管，加药物或等体积溶媒，细胞悬液 250 μL，均设 4 个复管。置 37 ℃ 水浴震荡温孵 15 min，加 1×10^-3 mol/L 细胞松弛素 B 2.5 μL，继续温孵 5 min，再加 2×10^-5 mol/L PAF 2.5 μL，继续温孵 5 min将试管移入冰浴，终止反应。4 000 r/min 离心 5 min，取上清作为释放酶液。

2.3中性白细胞总酶液及释放酶液的制备：取细胞悬液 3 mL，在冰浴中用 soniprep 150 细胞破碎仪超声 1 min(强度为 20 Am)，4 000 r/min 离心 15 min，取上清液作为总酶液。取总酶液 1 mL，于 80 ℃ 水浴中灭活 15 min，作为灭活酶液。

2.4β-葡萄糖苷酸酶的检测^［5，6］：依文献原理改为微量法。采用 96 孔酶标板，每孔加释放酶液或总酶液、灭活酶液 25 μL，2.5 mmol/L 酚酞葡萄糖醛酸 25 μL,0.1 mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6)100 μL。置 37 ℃、CO₂ 温孵箱内 18 h。每孔加 0.3 mol/L NaOH 150 μL终止反应并显色。在 550 nm 滤光片酶标仪上读数，计算酶释放量占总酶量的百分数。

2.5中性白细胞生成超氧阴离子()的检测^［7］：中性白细胞以 BSS 溶液(NaCl 8 g/L,KCl 0.4 g/L,CaCl₂ 0.14 g/L，MgCl₂·6H₂O 0.2 g/L，Glucose 1 g/L,HEPES 2.388 g/L，pH 7.4)悬浮，调节为2×10⁷ 个细胞/mL。采用 96 孔酶标板，每孔加细胞悬液 50 μL，药物或等体积溶剂 1 μL，BSS 液 125 μL。对照或药物均设 4 个复孔，置 37 ℃、CO₂ 温孵箱内 20 min 后加 1×10^-4 mol/L 细胞色素 C 25 μL，加1×10^-3 mol/L 细胞松弛素 B 25 μL，2×10^-4 mol/L PAF 2.5 μL，37 ℃ 温孵 10 min。在 550 nm 滤光片酶标仪上读数，以消光系数 21×10³ mol/L 计算 的生成量。

2.6中性白细胞负载 Fura-2/Am：中性白细胞以 HBSS-BSA 缓冲液(NaCl 8.0 g/L，KCl 0.44 g/L，CaCl₂ 0.134 g/L，MgCl₂·6H₂O 0.18 g/L，HEPES2.2 g/L，BSA 1.0 g/L，pH 7.4)悬浮，调至 1×10⁷ 细胞/mL。取细胞悬液 1 mL，加入适量的药物(DMSO＜0.5%)，再加入 1 mmol/L Fura-2/Am 3 μL，37 ℃ 水浴震荡 45 min 后，室温放置 15 min，3 000 r/min 离心 5 min。用 HBSS-BSA 液 5 mL 洗去残存于细胞外的 Fura-2/Am，共洗 2 次，再将洗好的白细胞悬浮于 2 mL HBSS-BSA 液中，37 ℃ 继续温孵 10 min。

2.7中性白细胞内游离钙浓度的测定^［8］：取上述负载 Fura-2/Am 的白细胞悬液 2 mL，加入 Hitachi F-4010 型荧光分光光度仪的吸收池中，保持在 37 ℃ 恒温及悬浮状态下，采用激发波长 340 nm(光栅 5 nm)，发射波长 500 nm(光栅 10 nm)，扫描速度 120 nm/min，先测定静息状态时的荧光强度(即静息时中性白细胞内游离钙浓度)。再分别于加入刺激剂 0.1 mmol/L PAF 或 fMLP 20 μL，10% Triton Ⅹ-100 20 μL，500 mmol/L EGTA(用 3 mol/L Tris 液调至 pH 8.7)100 μL 后进行测定。用计算机程度“program for Ca²⁺measurement(F-4010)Quin2 Fura2 Indol"处理实验数据。计算出静息状态和加刺激物后细胞内游离钙的浓度。

3结果

3.1银杏内酯 B 对中性白细胞释放 β- 葡萄糖苷酸酶的影响：中性白细胞分别与终浓度为 0.5，1，10，20，100 μmol/L 的银杏内酯 B 或对照溶剂温孵后，给药组 β- 葡萄糖苷酸酶的释放量分别比对照组降低 44.2%，48.4%，56.5%，63.6%，73.2%(图1)。

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