摘要毛细管电泳法分离丹参水溶性有效成分丹参素(DSS)、原儿茶醛(PAH)和原儿茶酸(PA)。分别考察电渗 流改向剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的浓度、电泳缓冲液pH值及电解质浓度、有机添加剂种类及浓度、运行电压、样品溶剂组成，以及检测波长等因素对有机阴离子类分析对象的峰迁移时间、分辨率、柱效的影响，优化选择的分离条件为：以pH为7.0，含0.5 mmol/L CTAB，浓度为200 mmol/L的磷酸盐溶液与乙腈按20∶5混合配制电泳缓冲液，在75 μm(id )×34.5 (eff. 30) cm的毛细管柱(柱温控制于20 ℃)上，10 kV(6 s)电迁移进样，运行电压为8 kV。在8 min内能将以20%乙腈-水为溶剂的样品，即内标(对羟基苯甲酸，p-HBA)，DSS、PAH和PA完全基线分离，柱效达40 万/米理论塔板数。

Separation of Water-Soluble Active Principles of Danshen (Salvia miltiorrhiza)

Danshensu, Protocatechuic Aldehyde and Protocatechuic Acid by HPCE

Rui Jianzhong Zou Hanfa

(Department of Clinical Pharmacology, Jinling HospitalYuan Yisheng and Lin) Shusen

（National Chromatographic Research & Analysis Centre, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences Dalian 116011）

AbstractWater-soluble active principles of Salvia miltiorrhize Bge. —Danshensu (DSS), protocatechuic aldehyde (PAH) and protocatechuic acid (PA) were separated by HPCE. Many factors that can affect the resolution, sensitivity and column efficiency of organic anion, including the concentration of cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), pH value, concentration of phosphate buffer, percentage of organic modifier in the buffer, running voltage, composition of solvent used for the sample, and detector wavelength were investigated to optimize the experimental conditions. Good separation of internal standard (p-hydroxy benzoic acid), DSS, PAH and PA can be achieved in less than 8 min under the following conditions: capillary column, 75 μm (id)×34.5 (eff. 30) cm, uncoated; column temperature controled at 20 ℃; detector, UV 200 nm; injection, 10 kV/6 s; running voltage, 8 kV; running buffer, 200 mmol/L phosphate buffer (pH 7.0, containing 0.5 mmol/L CTAB) and acetonitrile 5 mL in 20 mL (20∶5， v/v). Sample solvent was acetonitrile-water (2∶8 v/v). The column efficiency reached 400 000 per metre in thoretical plate number.

Key wordsHPCEDanshensu (DSS)protocatechuic aldehyde (PAH)protocatechuic acid (PA)

中药丹参Salvia miltiorrhza Bunge 的干燥根及根茎，性味苦微寒，为临床常用的活血药^［1］。丹参水溶性主要有效成分为丹参素(danshensu, DSS)，原儿茶醛(protocatechuic aldehyde, PAH)和原儿茶酸(protocatechuic acid, PA)。DSS能抗心肌缺血并对冠状动脉有作用，PAH能显著增加冠状动脉血流量，对抗ADP所致血小板聚集，并有广谱抗菌作用^［2，3］。丹参药材及各种制剂中DSS、PAH和PA的分离和测定方法有薄层层析-分光光度法，纸层析-紫外分光光度法，荧光光谱法，薄层扫描法和高效液相色谱法^［4，5］。

高效毛细管电泳(HPCE)是80年代以来迅速发展的新兴分析方法，具有高效、灵敏、快速、样品用量少，以及容易自动化、操作简便、溶剂消耗少、环境污染小等优点，在氨基酸、蛋白质、多肽和核酸等生物分子的分析中得到广泛应用，并迅速扩展到食品化学、环境化学、临床医学和药学中，CE分离有机分子、药物分子，特别是在手性分子和中药成分分析方面的能力，已显示出较大优越性^［6～9］。本文介绍用毛细管区带电泳(CZE)分离有机阴离子类中药成分丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸。

1材料和方法

1.1仪器：自动毛细管电泳仪Biofocus^® Capillary Electrop Horesis System 2000型(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)，紫外检测器；毛细管柱：75 μm×34.5 cm，河北永年光纤厂，有效长度为柱长减去4.5 cm，设柱温20 ℃；自动控制软件Biofocus operating software (Version 5.0)；pH计(杭州立丰仪表设备厂)。

1.2试剂和药品：氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇为分析纯，江苏太仓化工厂生产；甲醇、乙腈为色谱纯，江苏淮阴精细化工研究所生产；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自华美生物工程公司。对羟基苯甲酸(p-HBA)作为内标，购自SIGMA公司；丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸购自中国药品生物制品检定所。

1.3溶液配制：分别配制浓度为1.0，0.1 mol/L的NaOH溶液；浓度为100 mmol/L的磷酸二氢钠(pH 4.93)和磷酸氢二钠(pH 9.15)；配制浓度为100，150，200，250 mmol/L的磷酸盐背景缓冲液(由等浓度的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠按体积比为1∶1混合而成)；过滤重蒸水为去离子水。在考察和优化分离条件时，如CTAB浓度、有机添加剂种类和浓度、样品溶剂组成等，则在磷酸盐背景缓冲液中添加各种试剂配制而成。电泳冲洗液和电泳缓冲液在使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤，并超声脱气。

1.4新柱预处理：新的空柱分别用1.0 mol/L、0.1 mol/L的NaOH溶液和过滤重蒸水各冲洗60 min，活化柱表面，用氮气吹干后备用。

1.5电泳条件选择和优化

1.5.1CTAB浓度：被分析物为有机阴离子，带负电荷，其电泳方向和电渗流方向(正极→负极)相反，一方面电迁移方式难以进样，另一方面样品达到检测端的时间很长或无法到达检测窗。因此，采用电渗流改向剂CTAB，使电渗流方向由负极向正极，并使电泳仪的检测端电极为正极(-→+)，从而达到快速、高效的分离。在磷酸盐背景缓冲液中添加CTAB，配制成浓度分别为0.3，0.5，0.6，0.7 mmol/L的磷酸盐CTAB电泳缓冲液，考察电渗流改向剂浓度对分析时间的影响。

1.5.2缓冲液pH和浓度：分别配制含0.5 mmol/L CTAB的100 mmol/L磷酸二氢钠(pH 4.93)和磷酸氢二钠(pH 9.15)。另外，配制pH为7.0，含0.5 mmol/L CTAB，磷酸盐缓冲液浓度分别为100，150，200和250 mmol/L的电泳缓冲液。考察磷酸盐缓冲液的pH和浓度对分离效果的影响。

1.5.3有机添加剂：考察在磷酸盐背景缓冲液中添加有机试剂乙腈、乙醇和甲醇对分离效果的影响，以及添加的乙腈浓度高低对峰形和分辨率的影响。

1.5.4样品溶剂组成：在电泳缓冲液条件基本确定后，考察分别以水-乙腈(2∶8，)为溶剂配制的样品在含0.5 mmol/L CTAB 的200 mmol/L 磷酸盐电泳缓冲液中对羟基苯甲酸、原儿茶醛和丹参素的分离结果。

1.5.5运行电压：考察在优化选择的电泳缓冲液中，6，8，10 kV不同运行电压下分离效果，并选择分离速度快、分离效率高、运行稳定的电压。

1.5.6检测波长：考察标准液样品在不同检测波长下峰形和峰高的变化情况，选择灵敏度最高的测定波长。

2实验结果

2.1电渗流改向剂浓度与迁移时间的关系：当CTAB浓度为0.3 mmol/L，电渗流已改向，但样品出峰慢，迁移时间长，第一峰位(内标峰)出峰时间大于15 min，达不到快速分离的目的；当CTAB浓度为0.7 mmol/L，出峰较快，但高浓度样品中内标与原儿茶酸不能完全基线分离；用0.5 mmol/L浓度时，样品分离度高，峰迁移时间也较短。不同CTAB浓度下分离结果见图1。

毛细管电泳条件：电泳缓冲液为pH 7.0，200 mol/L磷酸盐-乙腈(20∶5)，CTAB：1=0.7 mmol/L，2=0.6 mmol/L，3=0.5 mmol/L；毛细管空柱为75 μm×34.5 (eff.，30 ) cm；电迁移在10 kV/6 s；运行电压6 kV；柱温为20 ℃；检测波长UV 200 nm；样品中各组分浓度均为0.50 μg/mL

1CTAB浓度对被分离组分峰迁移时间的影响

2.2缓冲液pH和电解质浓度与分离度的关系：样品在100 mmol/L磷酸二氢钠(pH 4.93)或100 mmol/L磷酸氢二钠(pH 9.15)背景缓冲液条件下分离差，而在100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中出峰良好，并达到相对较满意的分离度(见图2)。缓冲液中电解质浓度是影响分辨率的重要因素，低浓度的缓冲液不能使样品(特别是高浓度的样品)达到基线完全分离。随着缓冲液电解质浓度增大，分离度增大。但是，缓冲液电解质浓度过高时，加较低电压就产生较大的运行电流，因而限制了运行电压的提高，并易产生较大的焦耳热，稳定性下降。故选择磷酸盐浓度为200 mmol/L的缓冲液。

毛细管电泳条件：电泳缓冲液为pH 7.0，0.5 mmol/L CTAB，100 mmol/L磷酸盐-乙腈(20∶5)；运行电压10 kV；其<