摘要对金钱白花蛇进行几种凝胶电泳研究，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)谱带的位置和数目进行品种鉴别；用改进的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其主要蛋白质成分分子量；用等电聚焦电泳(IFE)测定其主要蛋白质成分的等电点(PI)。清晰的电泳谱带及相应数据为商品蛇真伪鉴别提供了科学依据。

Studies on Gel Electrophoresis Atlas of Soluble Protein in Bungarus

Chen Zhenjiang, Chen Keli, Wang Xi and Wu Hezheng

（Department of Pharmacy, Hubei College of TCMWuhan 430061）

Yao Mingquan

（Department of Pharmacy, Jingzhou No.1 Peoples's Hospital）

AbstractDisc polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)was performed to detect systematically the soluble proteins in Bungarus. Different species were identified according to the position and number of PAGE bonds.Molecular weights of the soluble proteins were measured by a modified sodium dodecyl sulfonate (SDS) procedure. Isoelectric focusing electrophoresis (IFE) was used to determine the isoelectric point of the main protein of Bungarus. Results showed that the IFE band were always quite distict, which can be used as a scientific basis to distinguish the genuine snakes from its confusable or faked varieties.

Key wordsBungaruspolyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)sodium dodecyl sulfonate (SDS)isoelectric focusing electrophoresis (IFE)

蛇类药材种类很多，其中金钱白花蛇为贵重药材，时有伪品现象发生。传统的鉴别主要依据药材的外形、鳞片、色斑、骨骼及某些器官的特征。目前，商品蛇中常见用游蛇科或其它科的幼蛇充真，本文采用PAGE技术鉴别金钱白花蛇的品种；用改进的SDS-PAGE技术测定金钱白花蛇蛋白质成分分子量，用IFE技术测定金钱白花蛇蛋白质成分等电点(PI)、结果满意，从而为蛇类药材及其制剂的生产、贮藏提供有价值的参考数据和图谱。

1实验材料

1.1水赤链游蛇：Natrix annularis (Hallowell).幼蛇。

1.2金钱白花蛇：为眼镜蛇科动物银环蛇Bungarus multicinctus Blyth幼蛇(购自湖北省中药材公司)。

1.3黄链蛇：为游蛇科动物黄链蛇 Dinodon flavozonatum Pope 幼蛇。

1和3两种样品由湖北省中医学院鉴定教研室提供并经陈科力副教授鉴定。

2实验仪器

DYY-Ⅲ4型电泳仪，DYY-27A型圆盘电泳槽、TGL-16C台式高速离心机。所用试剂均为AR级，双蒸水。

3PAGE

3.1试剂的配制^［1］：参照文献1的方法进行。所配各种试剂均应置于 4 ℃ 下贮存备用。

3.2样品液的制备^［2］：取样品各0.2 g分置于不同的研钵中，各加入1 mL生理盐水研磨成匀浆，以4 000 r/min离心 15 min，取上清液，各加入1倍量丙酮萃取，再将萃取液分置于半透膜袋透析 48 h(其间更换蒸馏水数次)，置冰箱中备用。

3.3电泳分析：取样品上清液加入1/2体积的40%蔗糖溶液，用微量进样器在凝胶管中点样，点样量为50 μL。在上电泳槽中加入2～3滴溴酚蓝指示剂示踪。电泳开始时电流控制2 毫安/管，待样品进入分离胶后加大为3毫安/管，当指示剂行至末端约1 cm 处时停止电泳。取出胶条，经染色与脱色处理后结果见图1。

Ⅰ-PAGE图谱Ⅱ-SDS-PAGE图谱Ⅲ-IFE图谱A-水赤链游蛇B-金钱白花蛇C-黄链蛇

1电泳图谱

4SDS-PAGE

4.1试剂配制^［3］：参照文献^［3］的方法进行。

4.2样品液制备：取样品各0.2 g，切碎分置于10 mL烧杯中加入适量乙醚浸泡脱脂，待有机溶剂挥发后转置于 10 mL 离心管(带塞)中各加水1 mL，超声振荡 30 min，以4 000 r/min 离心15 min，取上清液将其与水解液按1∶2混匀，置冰箱中过夜得样品处理液。取样品处理液 0.4 mL 加0.05%溴酚蓝和甘油各 0.05 mL 混匀即得点样用样品液。

4.3电泳分析：凝胶柱的制备，将凝胶母液、凝胶缓冲液、双蒸水、过硫酸铵(16 mg/mL)、四甲基乙二胺按10.1∶15∶3.4∶1.5∶0.045的比例配成溶液，注入已处理好的玻管中静置聚合 30 min 即可。然后，取样品液 0.1 mL，小心点入已吸去水层的凝胶柱顶端，并在上电泳槽电极缓冲液中滴2～3滴溴酚蓝示踪电泳即可开始。电流控制 8 毫安/管，待示踪剂行至凝胶末端约1 cm处时停止电泳，取出胶条(注意编号)用卡尺精确测量各胶条的长度。经染色、脱色后再测量各胶柱长度。

4.4标准蛋白的电泳与3同时在同一电泳槽中进行，编号分别是M(核糖核酸酶MW 13 500)、N(糜蛋白酶原MW 25 000)、O(胃蛋白酶MW 35 000)、P(牛血清蛋白MW 67 500)。

4.5样品电泳图谱及标准蛋白相对迁移率R_m与分子量的关系如图1，图2所示。

M-核糖核酸酶(MW=13 500)；N-糜蛋白酶原(MW=25 000)；O-胃蛋白酶(MW=35 000)P-牛血清蛋白(MW=67 500)

2用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线

相对迁移率R_m与样品主要蛋白质成分的分子量的求法是：

以上R_m为横坐标，已知分子量的标准蛋白的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制如图2所示的标准曲线图。图中M、N、O、P代表各标准蛋白。

5IFE^［4］

5.1试剂的配制与凝胶的制备：参照文献^［4］的方法进行，所用两性电解质为瑞典LKB公司Ampholyte 1809-101，pH=3.5～10，并制备两支空白凝胶。

5.2样品液的制备：参照前述4 的方法操作。样品称重0.5 g。

5.3等电聚焦：按文献^［4］的方法操作。

5.4固定及空白管 pH 梯度的测定：电泳结束后，取出各凝胶管(注意标记好管的上下端)用蒸馏水洗涤凝胶两端和玻管外壁，随后取出胶条并精确测量各样品胶柱长度后置于固定液中固定40 min，则各样品胶柱上会呈现清晰的乳白色IFE谱带，见图3。将空白胶柱(不经固定)按 0.5 厘米/段切成若干段，分置于已编号并各盛有1 mL 蒸馏水的 5 mL 的试管中4 ℃下浸泡1 h，用精密 pH 试纸测定各段浸泡液的 pH 值。以各段空白胶条所在位置(即胶柱长度)为横坐标，以相对应的浸泡液的 pH 值为纵坐标作图可得到 IFE 的 pH-胶柱长度关系曲线如图3所示。

图3IFE pH-胶柱长度关系曲线

因胶柱经固定后其长度会发生变化，故由 pH-胶柱长度关系曲线求被测样品所含主要蛋白质成分的PI值，所用长度是经校正后的长度：

根据各样品在各自 IFE 胶柱上的谱带位置(经校正后)再分别与 pH-胶柱长度关系曲线对比，可方便得到各样品蛋白质成分的 pH 值。

6结论与讨论

6.1PAGE、SDS-PAGE、IFE 图谱及有关数据图如图1～图3所示。

6.2动物类中药材含蛋白质成分较丰富。对金钱白花蛇进行 PAGE、SDS-PAGE 及 IFE 的系统研究尚属首次，结果都取得了令人满意的清晰的电泳谱带。经重复实验证明3种凝胶电泳的结果重现性良好。

6.3常规 PAGE 根据谱带位置与数目的不同，即可进行蛇类的品种鉴别。由图1知：正品只有一个明显的主带。

6.4改进的 SDS-PAGE 技术可精确测定金钱白花蛇主要蛋白质成分的分子量。如图2所示：图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 为样品1所含主要蛋白质成分分子量在标准曲线上所对应的位置，其相应的分子量是：Ⅰ(42 000)、Ⅱ(26 000)、Ⅲ(11 000)。A、B、C为样品2所含主要蛋白质分子量在标准曲线上所对应的位置。<