摘要为研究中药有效成分天花粉蛋白质( TCS )与苦瓜子蛋白质( MMC )的生物学活性，以细胞遗传物质DNA为底物，经分子生物学技术分析，发现超盘旋双链DNA发生解旋和链结，单链DNA发生断链，在合适条件下，已解旋和断链的分子还可重新盘绕，再成超盘旋，极微量的蛋白质即表现出很强的作用。这一活性与1型DNA拓扑异构酶相同。

The Action of Trichosanthin and Mommorcharin on DNA Configuration

I.Despiralization and Catenation of DNA

Qi ZuheYang XianrongJiang Xiaosonget al.

(National Laboratory of Medical Molecular Biology,

Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005)

AbstractTrichosanthin (TCS) and mommorcharin (MMC) are ingradients of Tianhuafen and Kuguazi respectively of Chinese traditional medicinal materials. TCS has been used clinically for inducing abortion. Recently their antitumor and antivirus activities were also reported. Especially the inhibition of HIV RNA in the cultured cells and the experimental treatment of AIDS with TCS had shed lights on the potential of Chinese medicinal materials to block HIV infection both in HIV carriers and AIDS patients. The MMC has the same characteristics as TCS. They all belong to the ribosome inactivating proteins (RIP) and perform ribonucleosidase activities similar to ricin. We found that the supercoiled double strand DNA could be decpiralized and catenated by TCS and MMC. While in optimal conditions the supercoiled conformation of the relaxed DNA could be reconstructed by TCS and MMC. During treatment of DNA with TCS or MMC in unfavorable conditions eg. in PBS or incubated at lower temperature the despiralization of DNA was the main display in agarose electrophoresis. While in the optimal conditions the catenation of DNA appeared in addition to the dispiralization. Sometimes all the DNA molecules became despiralized and catenated even with only 2 ～ 5 ng of TCS or MMC. This reaction was independent of ATP. The EDTANa₂ and DTT in the reactant was beneficial to the reconstruction of supercoiled configuration of the despiralized DNA. Based on the action of alteration of DNA configuration it was considered that these activities are similar to type 1 DNA topoisomerase.

Key wordstrichosanthinmommorcharindespiralizationcatenationtopoisomerase 1

天花粉蛋白质(TCS)与苦瓜子蛋白质(MMC)分别是中药天花粉与苦瓜子的有效成分。天花粉是栝楼的块根，属葫芦科，栝楼属Trichosanthes kirilowii Maxam。早在秦汉时代医书就记载有通月水等功用，七十年代，发现单味天花粉即可发挥良好的引产作用^〔1〕。天花粉中含有多种蛋白质，用丙酮分级沉淀法得到的精制蛋白质(trichosanthin TCS)是引产的有效成分，已制成结晶，其分子量25.682KD，由234个氨基酸残基组成单一肽链，蛋白质一级结构已经测定，高级结构也基本排出^〔2〕。近年来又发现除催产外，TCS还有抗肿瘤与抗病毒的功能，曾用HIV急性或慢性感染体外培养的细胞，证明TCS可选择性抑制HIV RNA的复制^〔3〕。因此试用于爱滋病的治疗，是有希望的抗HIV药物。苦瓜Mommordica charantia L.与天花粉统属葫芦科，用丙酮分级沉淀法分离和柱层析纯化，自其种子中得到的结晶蛋白质(mommorcharin MMC)是与TCS具有相同性质的药用有效成分，也已试用于治疗爱滋病。TCS，MMC与蓖麻毒蛋白均属于核糖体失活蛋白质类(RIP)^〔4〕，它们的生物学功能是医学研究中的重要课题，受到广泛关注，自从发现蓖麻毒蛋白具有糖苷酶活性后^〔5〕，相继证明TCS，MMC也具有相同性质^〔4，6〕，还有报道TCS，MMC有胰蛋白酶抑制剂的活性^〔7，8〕。自1988年我们发现TCS，MMC可使DNA解旋后，对这一新的现象作了继续验证^〔9，12〕，并对其作用机制作了进一步探讨。

1材料与方法

TCS自天花粉用常规方法分离，纯化，MMC自苦瓜子中提取，分离纯化方法与TCS相同，按洗脱峰的微小差异，分为αMMC, βMMC。M₁₃mp₈单，双链DNA按常规方法分离^〔13〕。电泳用琼脂糖凝胶(agarose)为进口分装，化学试剂均为分析纯。TCS，MMC与DNA在反应条件下保温，产物用常规1 % agarose电泳分离，根据DNA条带的变化判断结果，电泳液含40 mmol/L Tris. Cl, 20 mmol/L CH₃COONa, 1 mmol/L EDTANa₂ pH8.3, 当测试到最适反应条件后，一律用最佳条件保温与电泳。

2结果与讨论

2.1TCS与MMC使DNA解旋与链结的作用

2.1.1解旋双链DNA：纯化的质粒DNA按照分子体积的大小，在琼脂糖凝胶电泳图见图1上可分离出三条带，即超盘旋(supercoiled)带，分子结构紧密，体积最小，泳动速度最快。线性(linear)分子带，DNA双链断裂成线性，与缺口(nicked)分子带，即链上不同部位有缺口，但双链未完全断开，缺口使大分子高级结构松驰，因而体积最大，泳动速度最慢，如图1a中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。将0.5～1 μg DNA与TCS，aMMC，bMMC在非最适条件下保温10 min后，经1 % agarose电泳分离，发现DNA超盘旋区带1明显减少并上移，如图1 a Ⅰ ～ Ⅳ，有时Ⅰ带完全消失，说明分子体积增大，这是结构松驰的结果，实验证明这一改变DNA结构的作用与限制性内切酶与非特异性降解的DNaseI，以及外切酶的活性明显不同，当单一HinC11切点的M₁₃mp₈双链DNA被降解时，在反应过程中，也可见到超盘旋DNA量逐渐减少，线性DNA分子与缺口分子增多，但随保温时间的延长，或酶量增加，超盘旋与缺口分子最终消失，电泳图上为一条线性带，而TCS与MMC作用后，超盘旋带减少到一定程度后，即使再延长保温时间或增大用量，线性带并不增加，说明TCS与MMC对DNA的作用与内切酶不同，不是切断双链。

Ⅰ-超螺旋分子Ⅱ-线性分子Ⅲ-缺口分子

Ⅳ-解旋分子Ⅴ-链结分子1-对照2-DNA/aMMC

3-DNA/bMMC4-DNA/TCS

图1DNA的降解与链结电泳图

为除外其非特异性内切酶活性，又将DNA用微量的DNasel (8pg) 在非最适溶液中短时间作用，也可见DNA分子解旋，但当反应物100 ℃煮沸3 min立即放入冰水中使DNA解链后，在1 % agarose电泳图上，DNasel的反应管中，DNA分子变成小分子，而成为弥散带，而TCS的反应管与对照相比无明显变化，说明解旋非由断链所致。

为除外外切酶的活性，又将DNA用BamH1, Pst1, HinC11降解，造成5＇末端突出，3＇末端突出与平齐末端的DNA片段，再经TCS作用后，电泳图上，DNA片段的泳动速度反而变慢，说明片段并未减短反而长度增大，这是解旋作用造成的。另外也曾将DNA先与TCS作用，再用内切酶降解，发现DNA分子更容易被切断，这也可用分子松驰后更易于发生作用来解释。

又为除外蛋白质非特异结合对DNA结构的影响，以大于TCS十倍量的(牛血清白蛋白)BSA与DNA反应，并未出现DNA分子的解旋。上述各图从略

2.1.2链结作用：当TCS，MMC与DNA的反应物经最适温度处理5 min后，电泳图上除分离出DNA松驰分子的条带外，同时在靠近加样孔处可见到泳动度极慢的DNA分子聚集的大分子又称链结(catenation)。见图1-a Ⅴ。已发生链结的分子中，在进行电泳分离之前加入SDS至1 %，则可去除链结，而恢复分子的超盘旋状态，图1-b说明链结属分子的暂时聚集。实验表明，在非最适条件时以解旋为主，在最适条件时，链结明显，由于TCS与MMC有相同的表现，且bMMC作用更强，选TCS为靶，与DNA反应，电泳分离后，测定了反应的最适条件。

2.2解旋DNA的条件

2.2.1pH与缓冲液：比较磷酸缓冲液(1)与tris-C1缓冲液(2)，在不同pH与浓度下保温，可见在(2)溶液中，DNA分子解旋与链结比(1)明显，在最适条件时几乎全部分子均链结成大分子，见图2A。

A-最适pHB-最适温度C-最适时间D-最适浓度

1-对照Ⅰ～Ⅴ见图1

图2TCS，MMC使DNA分子发生解旋与链结的最适条件

2.2.2温度：在22 ℃至70 ℃间，取一定间隔反应，可见在低温时解旋明显，随温度增高，链结逐渐增强，表现为Ⅰ带逐渐减少，Ⅴ带逐渐增多，在最适温度时，DNA可全部呈链结状，超盘旋分子消失，全部解旋变大，见图2B。

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