摘要：介绍了银杏萜内酯的化学结构特征及性质，化学合成的方法，细胞工程研究的最新进展，生物合成研究的途径及萜内酯前体的研究。认为细胞生物工程及生物合成将为提高银杏产物中萜内酯的产量，保护银杏资源提供有效途径。

中图分类号：R914.5文献标识码：A

文章编号：1007-3213(2000)03-0266-05银杏科植物银杏Ginkgo biboba L.又名公孙树、白果树，是最古老的中生代孑遗植物之一，属我国特产珍贵药用植物。银杏提取物(简称EGb)及其制剂中主要活性成分是银杏黄酮和银杏萜内酯，其中银杏萜内酯被认为是银杏叶中起关键作用的活性成分。银杏萜内酯目前共分离提取到6种：二萜类化合物银杏内酯A、B、C、M、J(GinkgolideA、B、C、M、J，以下简称GA、GB、GC、GM、GJ)和倍半萜化合物白果内酯(bilobalide,BB)，它们都具有3个五元内酯环和一个罕见的特丁基等结构特征，迄今尚未发现存在于其他任何植物中。从20世纪60年代开始，国内外学者对银杏的药理和生理活性进行了广泛深入的研究，业已证实GA、GB、GC、GJ，均为血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)拮抗剂。BB可用于治疗脱髓鞘脑、脊髓和神经疾病，可能与神经系统生理活性有关^［1］。银杏萜内酯含量高低，对EGb及其制剂的内在质量起着关键的作用。由于萜内酯特殊的化学结构，化学与生物合成困难，分析难度大，故在现存文献中有关银杏黄酮的研究文献较多，而关于萜内酯的研究文献相对较少。随着对其有效成分认识的逐步深化，黄酮作为银杏中主要有效成分和质量指标的地位逐步下降，而作为银杏叶中主要活性成分的萜内酯的研究越来越受到重视。本文就国内外目前关于银杏萜内酯化学结构性质、合成的研究进展作一综述。

1银杏萜内酯的化学结构及性质研究

最早进行银杏化学成分研究的是20世纪20年代日本学者Furakawa和中西香尔^［2］。1932年Furukawa首次从银杏叶中分离到萜内酯化合物^［3］。1967年Maruyama等从银杏的根皮中分离到了GA、GB、GC和GM，他们通过¹H-NMR.MS及其他物理测试手段和化学反应，阐明了它们的化学结构^［3］，如图1。1969年Weinges从银杏叶中分离并鉴定了与二萜内酯结构相关的倍半萜化合物——白果内酯^［4］，如图2。1987年德国的Weinges小组又从银杏叶中分离到银杏内酯J^［5］。从图1可以看出银杏内酯具有独特的C₂₀笼型结构。这类化合物都含有一个螺(4，4)壬烷(A环与B环)，一个四氢呋喃环(D环)和3个γ-内酯环(C、E和F环)，并有一个特丁基侧链。顺式稠合的五元环F、A、D、C以特定方式折叠，形成一个大小恰当的半球形腔，该腔能接受大多数离子(Fe²⁺、Ca²⁺等)或某些有机基团，腔的两个平行边被F环和C环的C₁₁.C₁₂内酯环所限定，四氢呋喃环占据“笼”的中心位置，这一富含电子的腔适于键合正离子或正极性基团，而叔丁基则使其键合具有良好的立体专一性。

图1银杏叶中萜类化合物分子结构示意图

图2白果内酯的分子结构示意图

银杏内酯为强PFA拮抗剂，它们对PFA拮抗作用的IC₅₀：GA、GB、GC和GJ分别为7.4×10^-7、2.5×10^-7、7.1×10^-6和5.4×10^-5mol/L。可以看出GA和GB对PFA拮抗作用最强，尤其是GB。白果内酯对PFA拮抗性较弱，但对神经系统有保护作用^［6］。银杏内酯抗PAF的活性与D环、羟基位置有关，如C₁和C₃的2个羟基基团的存在，表明银杏内酯B是最有效的PAF拮抗剂。相反C₇上具有羟基基团的内酯C、M、J活性很小。银杏内酯对PFA的拮抗具有一定的专一特异性。银杏内酯基本骨架虽属非极性萜类，但因结构中有多个羟基取代，极性得到加强，不溶于石油醚和苯，易溶于醋酸乙酯、丙酮及低级醇类，略溶于水，这些化合物于酸性或中性溶液中稳定，遇强碱则内酯环打开而溶解，由于银杏内酯的刚性骨架固定了羰基间的距离，因此开环化合物经酸化后再环化能得到原来化合物，而白果内酯开环后再环合则得不到白果内酯本身，若加碱溶解制作针剂，则针剂中不存在白果内酯。

2银杏萜内酯的化学合成研究

银杏萜内酯在银杏中含量很低，一般含量在0.25％以下，且受地域、季节的影响很大。提取分离手续复杂，有学者对银杏萜内酯的合成途径进行了研究。

1986年Weinges进行白果内酯的半合成研究，并用¹³C-NMR对各步反应产物加以认定^［7］。1993年Crimmins等研究了白果内酯的全合成途径并获得了成功^［8］。

1988年Corey以包含26步反应的复杂而微妙的合成路线，第一次完成GB的全合成^［9］。其后又采用三内酯(trilactone)和GB两条途径合成了GA^［10］。1989年他们又合成了具有高度抗PAF活性而结构简单的GB同系物，并通过对3个类似GB的化合物的研究发现其中主要的活性部分似是C₄～C₁₂间的醚桥和C₄～C₆间的内酯桥，这可能拟似PAF结构中占举足轻重的乙酰基；认为在银杏内酯类的简单同系物中，很有可能再发现抗PAF活性更强的化合物^［11］。1992年Corey在研究GA、GB和GC的全合成途径反化学和生物学活性的基础上，通过对银杏内酯的特殊的羟基及其趋向的研究，阐明了这3种内酯化合物分子内和分子间羟基的反应所存在的差异，并将其应用于内酯的分离技术中。此外还通过向分子结构中引入稳定的³H标记(non labile lritium marker)研究从GC转变成GB的途径^［12］。但银杏萜内酯的分子立体结构复杂，化学合成途径的技术难度大。

3银杏萜内酯的生物合成研究

3.1细胞工程研究近年来国内外生物、生化学者开展了细胞工程及生物合成途径的研究。1991年Carrier等首次肯定了银杏组织培养物中银杏内酯的存在^［13］。1993年Huh等报道银杏内酯(GA+GB+GC)在愈伤组织和悬浮细胞中含量分别为0.0026％和0.0047％，而茎尖和内胚起源的根等器官的培养物中银杏内酯含量较高，分别为0.08％和0.03％^［14］。1995年Jeon等在用银杏叶诱导的愈伤组织和细胞悬浮培养中检测到了GB，并发现有MS培养基时GB含量最高，而Schenk-Hildebrandt培养基对细胞生长有利^［15］。1996年郑玉果在国内首次进行了利用组织培养法生产银杏萜内酯的研究。所 筛选的高产细胞株中GA+GB含量为0.0062％，达到了当时国外报道的最高水平^［16］。Laurain 等在1997年用野生型发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes A4菌株感染银杏合子胚诱导发根，建立了悬浮细胞培养系，同时用银杏胚囊(雌配子体)作外植体诱导，建立了悬浮培养系，用HPLC测定了GA、GB、GC、GJ和BB的含量。“转化”培养物中次生代谢物含量为0.065％，其中GB为0.0083％；在胚囊起源细胞悬浮培养物含量为0.87％，其中GB为0.16％；“转化”培养物中含有更多的BB，而GA、GB、GC在胚囊起源的培养物中含量更高^［17］。1997年孙天恩等利用发根农杆菌的Ri质粒转化银杏叶细胞，得到银杏叶转化发根。初步分析表明，银杏萜内酯的含量为0.04%～0.1％，其GA∶GB∶GC∶BB为8∶11∶1∶22，银杏黄酮的含量为0.06％～1％，并申请了发明专利(专利申请号97109254.4)^［18］。1997年Cartayrade等用［¹⁴C］CO₂、［U-¹⁴C］glucose饲喂3月龄的银杏幼苗，研究了GA、GB、GC和BB合成转移与积累的部位，示踪结果显示：催化产生银杏二萜类化合物终产物的所有酶促步骤均在根中，而非叶中；根 同时是银杏内酯与白果内酯合成及积累的部位，而叶只是贮藏部位；银杏二萜类在根与叶之间以源—池方式(source-sink manner)转移^［19］。1998年戴均贵在对不同培养基(MS、B₅、DCR、P₆)、激素(2，4_D、NAA、6_BA)、氮源(NO₃^、NH₄⁺)和碳源(蔗糖、葡萄糖、果糖)对银杏愈伤组织生长及银杏内酯B形成的影响研究中发现：MS、DCR和P₆3种培养基对愈伤组织Gb₃的生长及GB形成的效果都较好，它们之间不存在显著性差异，而B₅培养基的效果较差。2，4-D浓度的增加有利于愈伤组织的生长，当浓度为2.0mg/L时GB的含量最高；NAA浓度为0.5mg/L时愈伤组织的生长指数及GB的含量均达到最高；6-BA不利于愈伤组织生长及GB的形成。总氮量保持60mmol不变情况下，NH^＋₄与NO^-₃之比为1∶2时，GB的产量最高；NO^-₃有利于GB的形成，当NO^-₃为60mmol时GB的含量达到0.0183％。在蔗糖、葡萄糖和果糖3种碳源中，蔗糖效最佳，且浓度为4％时，愈伤组织生长指数达到3.66，GB的含量达到0.0223％^［20］。1999年陈云龙对银杏幼叶、种胚愈伤组织按文献方法进行诱导，MS固体培养基中含1.0mg/L NNA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖，调pH至6.0，培养温度(25±1)℃，每周继代1次，续代2代后，用HPLC测得银杏幼叶愈伤组织、种胚愈伤组织中GA的含量分别为0