摘要：目的：半定量检测体外培养的少量兔血管内皮细胞中特异mRNA的表达。方法：用Pharmacia Biotech公司的快速微量mRNA提纯试剂盒从兔内皮细胞中直接提取出mRNA，并以此为模板，用半定量RT-PCR技术检测培养的兔血管内皮细胞中内皮素(ET-1)mRNA的相对含量。结果：从10⁵个兔血管内皮细胞中提取出未降解的mRNA，A₂₆₀/A₂₈₀＞1.8；用半定量RT-PCR技术，测定出ET-1mRNA的表达。结论：本实验建立了一种从少量细胞中快速、简便、安全而可靠地检测特异mRNA表达的方法。

中图分类号：R392-33文献标识码：A

文章编号：1007-3213(2000)01-0081-04

Semi-Quantitative RT-PCR Analysis for Specific mRNA Expression from Minute Quantity of Rabbit Vascular Endothelial Cells

CHEN Yunbo,WANG Qi,CHENG Shuyi,LAI Shilong

(DME Center,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)

HOU Mengjun

(Central Laboratory,Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510120,China)

GAO Guoquan

(Dept of Biochemistry,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China)

Abstract:Semi-quantitative analysis is used for specific mRNA expression from minute quantity of cultured rabbit vascular endothelial cells.Total mRNA was abstracted from rabbit endothelial cells with QuickPrep Micro mRNA Purification Kit.Using mRNA as a template,the relative content of Endothelin-1(ET-1)mRNA was analyzed by semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction(SqRT-PCR)method.Results showed that the undergraded mRNA was extracted from 10⁵ cultured rabbit vascular endothelial cells,and its ratio of A₂₆₀/A₂₈₀ was more than 1.8.The quantity of ET-1 mRNA expression was determined with a method of SqRT-PCR.It is indicated that a rapid,simple,safe and reliable method of determining specific mRNA expression from minute quatity of cells is established.

Key words:GENE EXPRESSION/genetics;POLMERASE CHAIN REACTION/method;RNA,MESSENGER/isolation and purification;RABBITS

半定量反转录—聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction,SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法^［1］，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测各样品中特异mRNA的相对数量。虽然本方法较斑点杂交、Northern印迹法等所需的样品大为减少，但对于培养的细胞，仍需10⁶以上的细胞数量^［2］。为了检测培养的少量血瘀证兔模型以及对照组兔的血管内皮细胞中特异mRNA的含量，本实验采用Pharmacia Biotech公司的QuickPrep^ Micro mRNA Purification试剂盒，从10⁵个细胞中直接抽提出mRNA，并用半定量RT-PCR技术，检测了培养的兔血管内皮细胞中内皮素(Endothelin-1,ET-1)mRNA的表达。

1材料与方法

1.1动物新西兰纯种兔，雄性，体重1.0～1.5kg，由广东省卫生厅医用实验动物场提供。

1.2试剂QuickPrep^ Micro mRNA Purification Kit和相应的cDNA合成试剂盒，购自Pharmacia Biotech公司。dNTP、Taq酶购自Promega公司。Low DNA MASS Ladder和RNA酶抑制剂(RNasin)购自Life Technologies公司。焦碳酸二乙酯(DEPC)购自Serva公司。

1.3细胞培养按本室建立的血瘀证模型兔主动脉血管内皮细胞培养方法^［3］，选用原代细胞进行实验。

1.4mRNA的制备取10⁵的内皮细胞，用Pharmacia Biotech公司的快速微量mRNA提纯试剂盒提取细胞mRNA。提取完毕后，共获得0.4mLmRNA溶液，加入40μL的30mol/L KOAc，10μL糖原溶液(10g/L)及2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，4℃离心(相对离心力为16000×g，10min)后，-75℃保存。

将mRNA沉淀用70%乙醇洗涤干燥，加经DEPC处理的无菌水混匀后，用微量比色杯(经去RNA酶处理)在Pharmacia4000型紫外分光光度计上测定OD值，重复3次，用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检查mRNA的质量^［4］。

1.5反转录取25ngmRNA，置65℃变性10min，之后在冰上冷却。在1.5mL Eppendorf管中依次加入下列物质：热变性25ngmRNA，1μLOligo(dT)₁₈(0.5g/L)，cDNA合成试剂盒中第一链反应混合物(含鼠原逆转录酶M-MuLV,dNTP和反应缓冲液)1份及80U RNasin，总反应体系为33μL，混合均匀后，于37℃保温1h。

1.6PCR扩增兔ET-1寡核苷酸引物参照Takagi H.的文献^［5］由上海生物工程公司合成，可以扩增出自201bp～640bp(产物为440bp)的兔ET-1cDNA片段。

取2.0μL反转录液(cDNA)，加入0.2mmol/L dNTP,1.5mmol/LMg²⁺，10μL10×buffer,40pmol/L ET-1寡核苷酸引物，总反应体积50μL。最后加入50μL石蜡油 。PCR反应条件为95℃5min，然后进行下列循环：95℃1min，62℃45s，72℃1min，共32次循环。之后72℃再延伸7min。

1.7PCR扩增产物的定量检测准确吸取10μL扩增产物，用5.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，每次电泳都加2μL的定量DNAmarkers，2μLmarkers电泳后可分离出6条分子量分别为2000、1200、800、400、200、和100 bp的条带，这6条带分别含100、60、40、20、10、5 ng的DNA，其DNA含量与条带的IOD(Integral optical density)值呈直线相关关系。溴化乙锭(EB)染色后，在UVP凝胶图像分析仪上观察记录实验结果，并根据定量markers所得到的电泳各条带DNA含量和IOD值的关系曲线，对每一PCR扩增产物进行定量计算分析，数据表示()，单位为ng。

2结果

2.1兔血管内皮细胞mRNA提取与鉴定用快速微量mRNA提纯试剂盒从10⁵个内皮细胞中直接抽提出mRNA，A₂₆₀/A₂₈₀均在1.8以上。经EB染色的凝胶显示，mRNA呈弥散状，基本集中在5～10kb范围(图1)。

1mRNA的鉴定

M:2000bp;1200bp;800bp;400bp;200bp;100bp;(下同);

1～4:从不同样品中制备的mRNA

2.2兔血管内皮细胞ET-1mRNA的RT-PCRET-1mRNA的RT-PCR电泳结果发现，在一定的条件下，扩增出440bp的特异带，无明显的非特异产物出现。为排除可能的污染，在实验中同时设置两个阴性对照组，一是以mRNA为模板直接进行PCR反应，另一组不加任何模板。结果表明均未扩出440bp的ET-1目的cDNA片段(图2)。

2内皮素RT-PCR产物及阴性对照实验

1:ETcDNA;2:以mRNA为模板；3:未加模板

2.3RT-PCR扩增产量与总mRNA模板量的关系分别取25、50、100、150、200ng的mRNA进行RT-PCR反应，随着mRNA的增加，扩增产量也增加，存在明显的剂量—效应关系(图3)。根据定量markers计算出扩增产物量，绘制出扩增产量与mRNA模板量的关系曲线(图5)，用少至0.25ngmRNA即可检测到ET-1mRNA的表达。

3含量不同mRNA模板的内皮素RT-PCR结果

1:25ng,2:50ng,3:100ng.4:150ng,5:200ng

多次取同样量的mRNA模板(25ng)数份，进行RT-PCR反应，反应结果都表明其PCR产量相近(图略)，从多个泳道计算分析扩增产量为(11.8±0.48)ng(n=5次)，说明该方法具有良好的重复性。

2.4RT-PCR扩增产量与循环次数的关系取上述mRNA模板200ng，分5次进行RT-PCR，分别为15、20、25、30、35个循环，电泳后发现其扩增量与循环次数密切相关(图4)，